本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种中期因子mRNA在胸腔积液游离上清中的检测方法及其试剂盒。其方法特征在于，从GenBank中找出已知的人中期因子的mRNA全序列，设计一对荧光定量PCR引物，利用荧光PCR仪对胸腔积液中中期因子的mRNA含量进行检测。本发明专利技术还提供了基于本方法的试剂盒对胸腔积液中期因子游离mRNA进行检测，并结合癌胚抗原的检测对恶性胸腔积液进行诊断。本方法及试剂盒诊断的敏感性(86.9％)、特异性(91.8％)和准确性(88.7％)，并可对顺铂的个体化用药起指导作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
；本专利技术揭示中期因子在肺癌引起的恶性胸腔积液中的重要作用，阐明中期因子可以作为恶性胸腔积液的辅助诊断指标，以及中期因子的表达水平在恶性胸腔积液化学治疗中的作用。
技术介绍
恶性胸腔积液是肺癌的常见临床表现，其出现常提示预后不良。目前诊断恶性胸腔积液的标准方法仍然是基于细胞病理学检查。然而，即使重复的胸腔穿刺取样可在一定程度上提高病理检出率，通常情况下该方法诊断的敏感性只有50% -70%。在细胞学诊断阴性的情况下，随机胸膜活检在约7%的伴发胸水的病人中可提高其检出率，然而却有很高的手术相关并发症的危险，难以得到广泛应用。在临床中，我们常常遇到反复病理学检查阴性而临床表现高度怀疑为恶性体腔积液的病人；甚至在有些小量积液的情况下不能满足反复病理送检的要求而使得积液的性质难以明确。此外，以药物遗传学为平台检测药物疗效相关基因的表达及变异情况在恶性肿瘤化疗药物选择上有着极大的指导潜力。因此，如何充分利用恶性胸腔积液中的分子生物学信息以利于患者的诊断和治疗吸引了越来越多的关注。中期因子(Midkine，MK)属于肝素结合生长因子家族中的一员，是一种重要的生长分化因子。近年研究发现MK基因及蛋白可在多种恶性实体瘤中高表达，而在正常组织中低表达。这种高度组织分布特异性决定了其在肿瘤早期诊断中的重要价值。MK的表达与肿瘤发展的进程及严重程度密切相关，MK可能通过诱发瘤细胞的发生、促纤溶和细胞趋化、促进肿瘤血管的形成及增强肿瘤细胞的耐药性等机制促进肿瘤的发生发展。最近的研究表明，MK分子的表达与化疗药物Imatinib的疗效密切相关。然而相关的研究均局限在实体瘤水平。MK作为一种可分泌的因子，在肿瘤患者的尿液和血液中均可检出，而在胸腔积液这一体液中尚未明确MK的具体作用，也未有研究报道其与恶性胸腔积液诊断和治疗的关系。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供中期因子基因检测的方法和用途，用于作为肺癌引起的恶性胸腔积液的辅助诊断指标，或者作为恶性肿瘤治疗药物筛选的靶点。本专利技术的第一个方面，提供一种检测良恶性胸腔积液上清中中期因子基因表达的方法，其特征在于，可从Iml胸腔积液上清中检测出中期因子mRNA的表达水平，敏感性高，可重复性强。本专利技术的第二个方面，提供一种中期因子基因的用途，用于作为恶性胸腔积液的辅助诊断指标；其特征在于，利用胸腔积液中中期因子和癌胚抗原的联合检测提高诊断恶性胸腔积液的敏感性、特异性和准确性。本专利技术的第三个方面，提供一种恶性胸腔积液个体化治疗的方法，其特征在于，利、用恶性胸腔积液中中期因子的水平预测化疗药物顺钼的疗效。附图说明图一恶性胸腔积液患者积液上清中MK的表达量显著高于良性积液患者；图二恶性胸腔积液患者积液上清中CEA的表达量显著高于良性积液患者；图三CEA (A)和MK⑶诊断价值的ROC曲线；图四CEA和MK诊断性指标的敏感性、特异性和准确性；图五肺癌细胞系中MK表达与药物敏感性的关系A. MK mRNA在三株肺癌细胞系的表达水平；B.顺钼、健择和多西紫杉醇对三株肺癌细胞系的药物敏感性；图六顺钼(A)、多西紫杉醇⑶和健择(C)对恶性胸腔积液中原代肿瘤细胞的抑制率与MK表达水平的相关性分析。具体实施例方式本专利技术经过广泛的研究，首次证明了中期因子基因与恶性胸腔积液密切相关，并且中期因子基因可以作为恶性胸腔积液的一个辅助诊断指标。另外，本专利技术还研究了中期因子在恶性肿瘤个体化治疗药物筛选中的作用，从而为治疗恶性肿瘤提供了一个药物靶点。在上述基础上专利技术人完成了本专利技术。本专利技术还涉及定性及定量检测所述中期因子基因的水平，从而鉴别诊断良恶性胸腔积液的方法，这些方法是本领域所熟知的，它包括(但不限于)游离RNA提取、逆转录cDNA、实时荧光定量PCR等。所述中期因子基因的特异性引物也包含在本专利技术内，它们用于检测中期因子基因的表达水平。基于本专利技术的新发现，所述中期因子基因有多方面的新用途。这些用途包括(但不限于)I.用于制备恶性肿瘤临床检测的试剂盒；2.用于作为恶性胸腔积液临床诊断的辅助指标；3.用于筛选防治恶性胸腔积液的药物；4.用于评估药物对于恶性胸腔积液的治疗效果、预后分析以及治疗手段的挑选；5.直接用其单克隆抗体对恶性胸腔积液进行治疗。本专利技术的优点在于I.首次证明中期因子基因与恶性胸腔积液的相关性，使其可以成为恶性胸腔积液临床诊断的检测指标,为该疾病的防治提供了祀点；2.分析了大量恶性胸腔积液患者中中期因子基因的表达水平，并与良性积液相比较,结果准确可靠。材料及方法I.研究对象本专利技术共收集168例胸腔积液，均来自南京市胸科医院门诊与病房患者，其中恶性胸腔积液为107例，患者的原发肿瘤均为肺腺癌IV期；良性胸腔积液为61例，均为肺结核患者。168例患者中，男性113例，女性55例;< 60岁的89例，> 60岁的79例。2.标本的采集和处理为提取标本中的游离RNA，在无菌条件下行胸腔穿刺术，最初的200ml液体弃去后再收集液体，以避免导管内、皮肤表面的RNA酶污染；以灭菌一次性空针抽取胸水10ml，注入事先加入0. 5ml 3. 8%拘缘酸钠的无RNA酶管中；4000g，4°C离心10分钟，小心将上清转移至新管；4000g，4°C再次离心10分钟，吸取上2/3的上清至新管，以去除残存细胞可能；将上清Iml/管分装，-80°C冻存留待提取RNA用，每个分装物只能冻融一次。3.胸腔积液标本的生化检测胸水标本的生化指标由南京大学医学院附属鼓楼医院生化室检测并报告，检测 指标包括白细胞计数(WBC, X IO9)、中性粒细胞计数(Neutrophil, %)、淋巴细胞计数(Lymphocyte % )、总蛋白(Total protein, g/1)、乳酸脱氢酶(LDH, U/1)、腺苷酸脱氢酶(ADA, U/1)。4.胸腔积液标本的肿瘤标记物CEA检测采用ELISA试剂盒检测胸水中的CEA表达水平，具体步骤如下取出96孔板，在相应孔中加入50 u I标准品或标本；每孔加100 u I酶结合物，混匀30秒，37°C放置60分钟；倒出孔内混合液；每孔加350 u I洗涤液洗5次，并去除残余水珠；每孔加TMB 100 U 1，混匀10秒，37°C避光放置15分钟；每孔加100 ill反应中止液；混匀30秒，在30分钟内用酶标仪测450nm的OD值；用标准曲线计算CEA的表达水平(单位ng/ml)。5.游离RNA的提取和逆转录取Iml上清，融化后加入3ml Trizol LS，室温震荡15分钟；12000g，4°C离心15分钟；弃沉淀，吸取上清至新管，加入3. 2ml氯仿，剧烈震荡后室温放置15分钟；12000g，4°C离心15分钟；取上层无色水相，加入等体积的异丙醇沉淀RNA，轻轻颠倒混匀10次，-200C过夜；12000g，4°C离心15分钟；除上清，用Iml 75%的乙醇洗涤RNA沉淀，用7500g的速度在4°C离心5分钟，除上清后干燥15分钟；用不含RNA酶(RNase free)的水溶解RNA，60°C水浴10分钟，重溶RNA，用核酸定量仪定量。在冰上配制逆转录反应液，体系为5XExScript Buffer 4 U I> dNTP MixtureI U I、R本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王婷婷，侯亚义，吕明明，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：
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