溶血性链球菌检测用引物组及方法技术

本发明专利技术涉及一种溶血性链球菌检测用引物组，包括下列引物：F3引物：CTC?ACAATC?GTC?TTA?GTA；B3引物：CAT?AAC?ACA?CTG?GGT?TCT?TGAAT；FIP引物：CTC?TAT?GAA?TCG?CCG?GTC?TAG?ATG?TAG?ACT?GCT?CATGTT?GTT?AGC?CTG；BIP引物：CTT?CGT?GCA?TGA?TAG?GTG?GAC?GTGAAT?CGG?GTC?AAT?CCT?ATA?GC。本发明专利技术还提供一种使用上述引物组检测溶血性链球菌的方法。本发明专利技术的检测方法具有特异性高、重复性好、快速可靠的优点，为溶血性链球菌的检测提供一强力有效的手段。

【技术实现步骤摘要】
溶血性链球菌检测用弓I物组及方法
本专利技术属于食品安全领域，涉及环介导等温扩增技术，具体涉及一种。
技术介绍
溶血性链球菌在自然界中分布较广，存在于水、空气、尘埃、粪便及健康人和动物的口腔、鼻腔、咽喉中，可通过直接接触、空气飞沫传播或通过皮肤、粘膜伤口感染，被污染的食品如奶、肉、蛋及其制品也会对人类进行感染。(I) a-溶血性链球菌菌落周围有l-2mm宽的草绿色溶血环，也称甲型溶血，这类链球菌多为条件致病菌。(2) P -溶血性链球菌菌落周围形成一个2-4mm宽、界限分明、完全透明的无色溶血环，也称乙型溶血，因而这 类菌亦称为溶血性链球菌，该菌的致病力强，常引起人类和动物的多种疾病。溶血性链球菌常可引起皮肤、皮下组织的化脓性炎症、呼吸道感染、流行性咽炎的爆发性流行以及新生儿败血症、细菌性心内膜炎、猩红热和风湿热、肾小球肾炎等变态反应。溶血性链球菌的致病性与其产生的毒素及其侵袭性酶有关。上呼吸道感染患者、人畜化脓性感染部位常成为食品污染的污染源。一般来说，溶血性链球菌常通过以下途径污染食品1、食品加工或销售人员口腔、鼻腔、手、面部有化脓性炎症时造成食品的污染；2、食品在加工前就已带菌、奶牛患化脓性乳腺炎或畜禽局部化脓时，其奶和肉尸某些部位污染；3、熟食制品因包装不善而使食品受到污染。虽然传统溶血性链球菌检测方法是可靠的，但却很费力、耗时，需要4 7天才能完成。由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。因此，在需要及时、快速评价食品中微生物的安全性时，通常不被采用。随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，人们已创建了不少快速、简便、特异、敏感且适用的溶血性链球菌检测方法，其中许多可以在48h内检出溶血性链球菌，这些方法通称为快速检测。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedIsothermal Amplification,LAMP)是日本的荣研株式会的Notomi T等2000年在Nucleic. Acids. Res.杂志上报道的一种新的核酸扩增方法。LAMP方法是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，利用链置换DNA聚合酶在恒温条件保温几十分钟，完成核酸扩增反应。可以在I小时之内，将靶基因DNA片段扩增109-1010倍，并且只要用肉眼观察白色混浊沉淀，就能鉴定是否扩增，不需要电泳检测过程。LAMP方法的原理决定了它具有许多其它DNA扩增方法无法比拟的优点(I)操作简单，无需特殊设备。LAMP反应在等温状态下就能进行，无需预先进行双链的变性。同时LAMP反应不需要特殊仪器和试剂，只需要将PCR反应中的Taq DNA聚合换成具有链置换活性的Bst DNA聚合酶。(2)灵敏度高。LAMP方法能检测到比PCR方法还少的拷贝数，其灵敏度可以比PCR法高10 100倍。(3)特异性强。LAMP应体系要求四条引物完全匹配才能进行扩增，信息量大，因此反应体系中的其他模板对反应的干扰很小。(4)速度快，耗时短。LAMP反应不需要加热变性，省去了热循环步骤，40 60min即完成扩增反应。(5)可直接扩增RNA。扩增RNA时，只要在扩增DNA试剂的基础上加上逆转录酶和酶阻抑剂，就能一步实现RNA的扩增。科学家们已经建立了逆转录LAMP (RT-LAMP)方，该方法的灵敏度是RT-PCR方法的100倍。(6)产物检测方便、快捷。LAMP反应只要用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度就能够判断扩增与否，进行实时验证。
技术实现思路
本专利技术要解决的一个技术问题是，提供一种对溶血性链球菌具有特异性的引物组。上述技术问题通过以下技术方案实现一种溶血性链球菌检测用引物组，其特征在于，包括下列引物 F3 引物CAGTCAATCCTCGGTCAG ；B3 引物GAITTCACATAAGGATGTGTCTA ；FIP 引物:CAGTATGTATGGCAGGTATCGAAGTAAACAGGTCTTGATGTTAGCCTG ；BIP 引物GCGTGGGCTTGATAGGTGGACGTTTATACGGTCCTTCGTAAAGC。本专利技术要解决的另一个技术问题是，提供一种利用上述引物组基于环介导等温扩增法检测溶血性链球菌的方法。上述技术问题通过以下技术方案实现一种溶血性链球菌的检测方法，具体为(101)对待检样品提取待检I旲板DNA待检样品用增菌液进行培养，得待检增菌液，取ImL待检增菌液，7000Xg离心2min，尽量吸弃上清液；加入80 ii L DNA提取液，混匀后沸水浴lOmin，置冰上IOmin ；7000 X g离心2min，取上清液作为待检模板DNA ；(102)溶血性链球菌的环介导等温扩增按下述LAMP反应体系，在反应管中加入相应反应液、Bst DNA聚合酶，混匀，然后加入稳定液，最后在反应管中加入待检模板DNA，进行65°C环介导等温扩增反应60min ；LAMP反应体系为权利要求1.一种溶血性链球菌检测用引物组，其特征在于，包括下列引物 F3 引物CTC ACA ATC GTC TTA GTA ； B3 引物CAT AAC ACA CTG GGT TCT TGA AT ； FIP引物CTC TAT GAA TCG CCG GTC TAG ATG TAG ACT GCT CAT GTT GTT AGC CTG ； BIP引物CTT CGT GCA TGA TAG GTG GAC GTG AAT CGG GTC AAT CCT ATA GC。2.—种溶血性链球菌的检测方法，其特征在于，具体为 (101)对待检样品提取待检模板DNA 待检样品用增菌液进行培养，得待检增菌液，取ImL待检增菌液，7000 X g离心2min，吸弃上清液；加入80iiL DNA提取液，混匀后沸水浴lOmin，置冰上IOmin ;7000 X g离心2min，取上清液作为待检模板DNA ； (102)溶血性链球菌的环介导等温扩增 按下述LAMP反应体系，在反应管中加入相应的引物、dNTPs、ThermoPol缓冲液、MgS04、Bst DNA聚合酶、水,混匀,然后加入甜菜碱,最后在反应管中加入待检模板DNA,进行65°C环介导等温扩增反应60min ；3.根据权利要求2所述的溶血性链球菌的检测方法，其特征在于，当LAMP反应体系的总体积为25 u L, LAMP反应体系具体为4.根据权利要求2所述的溶血性链球菌的检测方法，其特征在于，所述标准菌株模板DNA，通过如下方法取得将溶血性链球菌标准菌株接种于葡萄糖肉浸液肉汤中36°C ±1°C培养18h 24h，用无菌生理盐水稀释至约IO6 108CFU/mL(约麦氏浊度0. 4)，得稀释液，然后取ImL稀释液加到I. 5mL无菌离心管中，7000 X g离心2min,吸弃上清液；加入80 y LDNA提取液，混匀后沸水浴lOmin，置冰上IOmin ;7000Xg离心2min，取上清液作为标准菌株模板 DNA。全文摘要本专利技术涉及一种溶血性链球菌检测用引物组，包括下列引物F3引物CTC ACAATC GTC TTA GTA；B3引物CAT AAC ACA CTG GGT TCT TGAAT；FIP引物CTC TAT GA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种溶血性链球菌检测用引物组，其特征在于，包括下列引物：F3引物：CTC？ACA？ATC？GTC？TTA？GTA；B3引物：CAT？AAC？ACA？CTG？GGT？TCT？TGA？AT；FIP引物：CTC？TAT？GAA？TCG？CCG？GTC？TAG？ATG？TAG？ACT？GCT？CAT？GTT？GTT？AGC？CTG；BIP引物：CTT？CGT？GCA？TGA？TAG？GTG？GAC？GTG？AAT？CGG？GTC？AAT？CCT？ATA？GC。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王小玉，冯家望，唐食明，胡松楠，游淑珠，邝筱珊，
申请(专利权)人：王小玉，冯家望，唐食明，
类型：发明
国别省市：