本发明专利技术公开了一种基于EST数据挖掘的抗病基因同源物的标记方法，其步骤：（1）序列挖掘及引物设计；（2）RGA序列挖掘及引物设计：通过文献收集了96条不同物种的R蛋白序列，同时下载拟南芥中196条R蛋白序列，从TIGR中下载3个棉种的EST数据；（3）对开发的标记进行遗传定位:所用的海陆种间BC1群体，然后在单链构象多态性电泳条件下利用亲本鄂棉22和3-79筛选多态性，筛选出的多态性标记对BC1群体进行多态性分析，数据导入JoinMap3.0构建。本发明专利技术成本更低，无需简并引物扩增与大量单克隆测序非费用，而且得到的序列数目更多，序列类型也更加丰富。能够为分子育种提供有效的分子标记。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于棉花抗病育种
，更具体涉及一种基于EST数据挖掘的抗病基因同源物(Resistance genes homologues, RGHs)的标记方法,方法易行，操作简便,能够高效的用于植物抗病育种，缩短了育种时间，并降低了费用。
技术介绍
作物生长过程中会受到多种病虫害的危害，导致产量或品质下降。通过分子育种培育抗病品种对于减轻病害危害、保证高产优质以及减小农药使用量等方面起很重要的作用。除了已完成基因组测序的少数作物如水稻、玉米等之外，大部分农作物抗病研究基础薄弱或存在一些天然的弱势。某些作物基因组庞大且重复序列多，又或者多态性比率 较低，难以构建高密度遗传连锁图谱，导致难以找到与目标性状紧密连锁的分子标记；针对抗病材料构建遗传图谱，或利用关联分析或连锁分析方法等筛选大量种质资源获取抗性材料等，又可能涉及费用过高或工作量较大的问题。开发与作物抗病基因或性状紧密连锁的分子标记，才能够降低这些作物抗病育种的难度与费用。广义上的植物抗病基因同源物包括防御基因类似物与抗病基因类似物(Resistance gene analogs,RGA)。病程相关蛋白属于防御基因一类,在植物收到生物或非生物胁迫时表达，一般参与植物广谱抗性。其作用机理主要有三种一是加固细胞壁、自我保护；二是抑制真菌、细菌生长或病毒复制；三是合成植物抗毒素和细胞内毒素。抗病基因通过与病原物非亲和因子相互作用，最终激活抗病反应的信号传导网络；或者与病原物亲和因子相互作用，使亲和性因子失活而失去病害诱发作用。一般抗病基因一般对不同病原物具有特异抗性。RGA可能是植物抗病基因或其假基因的一部分，通过水稻、拟南芥等基因组RGA物理图谱定位，发现RGA常成簇存在且簇内成员包含有植物抗病基因。这个特性导致RGA标记与抗病基因连锁的概率远远高于随机标记，能够高效的用于植物抗病性与分子标记的连锁分析，进而克隆植物抗病基因或进行分子标记辅助育种。并且由于RGA属于快速演化序列，能够高效用于抗性种质资源多样性研究。Collins利用用与玉米抗锈病基因Rpl-D连锁的R基因同源序列Pic20为探针，从基因组文库中筛选到含有Rpl-D基因的克隆。Wang利用大豆R为混合探针，从大豆cDNA文库筛选得到一个受外源水杨酸诱导表达的全长基因KR3。大部分RGH (Resistance genes homologues)都是利用简并引物扩展基因组DNA得到的，扩展后一般需要挑选单克隆进行测序。由于大量假基因的干扰，这些RGHs不太可能是功能基因。如果使用cDNA为模板，随机挑选克隆时高量表达的RGHs也很容易覆盖掉微量表达的RGHs。大部分的简并引物都是利用数目有限的几个基序(motif)来设计引物，导致只有几个保守域可以被扩增。如许多简并引物都是基于R基因NBS区域的P-loop、Kinase2、Kinase3a和GLPLAL等设计的引物，则扩增产物也只能包括NBS区域，无很难获取NBS侧翼序列。一些不适于设计简并引物的基因也较难得到同源序列。而利用EST数据库挖掘RGHs则可以部分克服这些问题。数据挖掘无需经过简并引物扩展与挑选大量单克隆测序的过程，EST来源RGHs更加可能为功能基因而且海量数据可以克服表达量水平不同造成的影响。对于全基因组测序完成的物种，利用数据挖掘的方法可以得到全基因组范围内的所有RGHs。利用EST数据库挖掘的RGHs的多样性也比利用简并引物扩增更加丰富
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种基于EST (Expressed Sequence Tag)数据挖掘的抗病基因同源物(Resistance genes homologues, RGHs)的标记方法,方法易行,操作简便，能够高效的用于植物抗病育种，缩短了育种时间，并降低了费用。本专利技术通过以下技术方案实现本专利技术通过数据挖掘方法获取抗病基因同源物并将其转化为分子标记的方法，能够大大加快植物抗病育种进程。一种基于EST数据挖掘的抗病基因同源物的标记方法，其步骤是(I)病程相关蛋白(pathogenesis-related protein, PRP)序列挖掘及引物设计陆地棉EST 序列下载于 TIGR (http://plantta.jcvi.org/)。使用关键词(PR、Pathogenesis 和 Pathogenesis-related protein)搜索获取 PRP 序列。非目标序列与冗余序列使用人工排除。引物设计使用Primer-BLAST，参数设置为最佳退火温度55_60°C，PCR产物大小100-500bp，引物最适长度设置为20bp，引物命名规则为序列ID+PR。(2)抗病基因类似物(Resistance gene analogs, RGA)挖掘及引物设计通过文献收集了 96条不同物种的克隆的R蛋白(Resistant gene protein,抗病基因蛋白)序列，其中部分抗病基因可能有多条同源蛋白序列。同时下载拟南芥中196条 R 蛋白序列(http://niblrrs. ucdavis. edu)。从 TIGR 中下载 3 个棉种(G. arboreum、G.raimondii和G. hirsutum)的EST数据。使用本地tBLASTn对将3个棉种EST数据与克隆的R蛋白和拟南芥的R蛋白序列进行比对，E值设置为10,。以相似性> 40%为阈值初步挑出序列，将这些核酸序列转换为蛋白序列后使用NCBI提供的Conserved Domain Search工具分析其保守域。包含抗病相关保守域的序列被列为RGA。挑出的PK类序列会再次与R蛋白进行比对，只有相似性> 75%才被认定为RGA。一般在蛋白质结构域对应的核酸区域两侧设计引物，无法做到时则采用较长的引物序列，引物设计参数与PR引物相同，命名规则为序列ID+RGA。通过与拟南芥基因组比对发现部分棉花RGA可能包含内含子，在这些潜在包含内含子区域两侧设计了部分引物，命名规则为序列 ID+RGA-ILP，例如 BQ410602RGA-ILP 和 BQ412690RGA-ILP。(3)对开发的标记进行遗传定位本实验室已构建有作图所用的海陆种间BC1群体(Yu Y，Yuan DJ, LiangSG, Li XM, Wang XQ, Lin ZX*, Zhang XL. Genome structure of cotton revealed by agenome-wide SSR genetic map constructed from a BC1 population between Gossypiumhirsutum and G. barbadense. BMC Genomics, 2011，12:15)。然后在单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP)电泳条件下利用亲本鄂棉 22 和3-79(请见遗传资源表)筛选多态性。筛选出的多态性标记对BC1群体进行多态性分析，数据导入JoinMap3. O构建遗传图谱(LOD值设为5.0), Mapchart2. 2软件(VoorripsRE. MapChart, software f本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于EST数据挖掘的抗病基因同源物的标记方法，其步骤是：（1）序列挖掘及引物设计:陆地棉EST序列下载,使用获取PR序列,引物设计使用Primer？BLAST，参数设置为：退火温度55？60℃，PCR产物大小100？500bp，引物长度设置为20bp;（2）RGA序列挖掘及引物设计:通过文献收集96条不同物种的R蛋白序列，同时下载拟南芥中196条R蛋白序列,从TIGR中下载3个棉种的EST数据,使用本地tBLASTn？进行比对，E值设置为10？10,以相似性≥40%？为阈值初步挑出序列，将核酸序列转换为蛋白序列后使用NCBI提供的Conserved？Domain？Search工具分析其保守域,包含抗病相关保守域的序列被列为RGA,挑出的PK类序列会再次与R蛋白进行比对，只有相似性≥75%才被认定为RGA,在包含内含子区域两侧设计了引物，命名规则为序列ID+RGA？ILP;（3）对开发的标记进行遗传定位:所用的海陆种间BC1群体,然后在单链构象多态性电泳条件下利用亲本鄂棉22和3？79筛选多态性,筛选出的多态性标记对BC1群体进行多态性分析，数据导入JoinMap3.0？构建遗传图谱，Mapchart？2.2？软件绘制遗传连锁图谱;（4）半定量RT？PCR验证表达:海岛棉3？79和陆地棉鄂棉22采用蛭石种于温室内，两叶一心期幼苗时用黄萎病病菌V991进行沾根法诱导，诱导后0、？6、24、48、72和96小时取根部样品，提取RNA反转为cDNA后用于半定量RT？PCR验证。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林忠旭，张献龙，任高峰，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。