实时切割分析制造技术

本发明专利技术提供基于切割的实时PCR分析方法。一般而言，所述分析方法包括：使包括a）扩增核酸靶的PCR试剂和b）在扩增的靶上进行活瓣切割分析的活瓣切割试剂的反应混合物经受两组热循环条件。所述第一和第二组循环之间不向反应加入额外的试剂，并且，第二组循环的每个循环中，测量活瓣探针的切割。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】实时切割分析相关申请的交叉引用本申请要求2010年11月15日递交的美国专利申请系列号12/946,737的申请日的优先权，该申请公开的内容通过弓I入的方式并入本文。背景人类基因组中的一些点突变与疾病有直接关联。例如，发现一些生殖系KRAS突变与努南综合征(Schubbert等人.Nat.Genet.200638:331-6)和心-面-皮肤综合征(Niihori等人.Nat.Genet.200638:294-6)相关联。同样，发现体细胞的KRAS突变在白血病、结直肠癌(Burmer 等人.Proc.Natl.Acad.Sc1.198986:2403-7)、膜腺癌(Almoguera 等人.CeI1198853:549-54) 和肺癌(Tam等人.Clin.Cancer ReS.200612:1647-53)中高频出现。人类基因组中有许多点突变与疾病没有明显的致病关联。点突变的检测方法可用于，例如，提供与点突变相关联的疾病的诊断。概述本专利技术提供基于切割的实时PCR分析方法。在某些实施方案中，所述分析方法包括使包括a)扩增核酸靶的PCR试剂、和b)对所扩增的核酸靶进行活瓣(flap)切割分析的活瓣切割试剂的反应混合物经受两组热循环条件。第一组热循环条件包括一组5-15个以下循环:1.至少90°C的第一温度；i1.范围为60°C-75°C的第二温度；ii1.范围为65°C-75°C的第三温度。所述第二温度和第三温度可以相同。第二组热循环条件包括一组20-50个以下循环:1.至少90°C的第四温度；i1.比第二温度低至少10°C的第五温度；ii1.范围为65°C _75°C的第六温度。在某些情况下，第一组和第二组循环之间不向反应加入额外的试剂，并且，在第二组循环的每个循环中，测定活瓣探针的切割。附图简述附图说明图1示意性说明了活瓣分析的一些一般原则。图2显示使用单阶段热循环完成的分析的结果。野生型中存在的KRASG35T突变序列水平的检测和定量如图所示。动力学曲线显示突变体与野生型的所有比例除了 1:10和1:100之外的是无法区分的。图3显示使用两个阶段热循环完成的分析的结果。野生型中存在的KRALSG35T突变序列水平的检测和定量如图所示。动力学曲线显示比例从1:10至1:10，000的分辨率。定义本文使用的术语“样品”涉及材料或材料的混合物，通常情况下，尽管这不是必须的，以液体形式，含有一种或多种感兴趣的分析物。术语“核苷酸”旨在包括那些不仅包含已知嘌呤和嘧啶碱基而且包含已被修饰的其他杂环碱基的基团(moieties)。这些修饰包括甲基化的嘌呤或嘧啶，酰基化的嘌呤或嘧啶，烷基化的核糖或其他杂环。此外，术语“核苷酸”包括那些包含半抗原或荧光标记并可以不仅包含常规核糖和脱氧核糖的糖，而且也可以包含其他糖的基团。修饰的核苷或核苷酸也包括对所述糖基团的修饰，例如，一个或多个羟基被卤素原子或脂肪族基团取代，官能化为醚、胺等。术语“核酸”和“寡核苷酸”在本文中可以互换使用，用于描述任意长度的聚合物，例如，长于大约2个碱基，长于大约10个碱基，长于大约100个碱基，长于大约500个碱基，长于大约1000个碱基，长达大约10，000个或更多碱基组成的核苷酸，例如，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，并可通过酶法或合成法制备(例如，PNA记载于美国专利号5，948，902和其中所引用的参考文献)其可以与天然存在的核酸以序列特异性的方式进行杂交，该方式与两种天然存在的核酸杂交类似，例如，能够参与沃森-克里克碱基配对相互作用。天然存在的核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶(分别为G、C、A和T)。本文使用的术语“核酸样品”指含有核酸的样品。本文使用的术语“靶多核苷酸”指研究中的目的多核苷酸。在某些实施方案中，靶多核苷酸含有研究中的一个或多个目的靶位点。本文使用的术语“寡核苷酸”指大约2至200个核苷酸的核苷酸单链多聚体。寡核苷酸可以通过合成或可以通过酶法制备，并且，在一些实施方案中，长度为10至50个核苷酸。寡核苷酸可以含有核糖核苷酸单体(即，可以为寡核糖核苷酸)或脱氧核糖核苷酸单体。例如，寡核苷酸的长度可以为10至20、11至30、31至40、41至50、51至60。61至70,71至80、80至100、100至150或150至200个核苷酸。本文使用的术语“双链体”或“双链的”描述两个互补的碱基配对的多核苷酸，SP，杂交在一起。本文使用的术语“引物”指这样的寡核苷酸，其具有与靶多核苷酸的一个区域互补的核苷酸序列。在引物延伸条件下，使用靶核酸作为模板，引物结合至所述互补区域并延伸。引物可为大约15至大约50个核苷酸范围内，但也可使用在上述长度范围之外的引物。引物可通过聚合酶的作用从引物的3’末端开始延伸。不能通过聚合酶的作用从其3，末端开始延伸的寡核苷酸不是弓I物。本文使用的术语“延伸”指向核酸末端添加一个或更多的核苷酸，例如通过寡核苷酸的连接或通过使用聚合酶。本文使用的术语“扩增”指使用靶核酸作为模板产生一个或更多拷贝的靶核酸。本文使用的术语“变性”指核酸双链体分开为两条单链。本文的术语“测定(determining)”、“测量(measuring) ”、“评估(evaluating)”、“评估(assessing) ”、“分析(assaying) ”、“检测(detecting) ”、“分析(analyzing) ” 可以互换使用，指任何形式的测量，并包括测定一种成分(element)存在与否。这些属于包括定性和/或定量测定。评估可为相对或绝对。“评估其存在”包括测定存在的某种物质的量，以及测定其存在或不存在。术语“使用”有其常规含义，因此，是指采用，例如，将方法或组合物付诸运行至结束。本文使用的术语“Tm”指寡核苷酸双链体的解链温度，在该温度，一半的双链体保持杂交而一半的双链体解离成单链。寡核苷酸双链体的Tm可以通过实验测定或使用下述公式预测:Tm=81.5+16.6(log1Q[Na+])+0.41(部分 G+C)-(60/N)，其中 N 是链长且[Na+]小于IM0 参见 Sambrook 和 Russell (2001;Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rded.,Cold Spring Harbor Press, Cold Spring HarborN.Y., ch.10)。还有其他预测寡核苷酸双链体的Tm的公式并且一个公式可以或多或少地适用于给定的条件或一组条件。本文使用的术语“Tm_匹配的”指多个核酸双链体有在定义范围内的Tm，例如，在互相的5°C或10°C范围内。本文使用的术语“反应混合物”指试剂的混合物，所述试剂能够在能够在适当的外部条件下经过一段时间一起反应产生产物。反应混合物可以包含PCR试剂和活瓣切割试剂，例如，各自在本领域已知的配方。本文使用的术语“混合物”指成分的组合，所述成分是散在的并没有任何特定顺序。混合物是异质的且没有在空间上分离成其不同成分。混合物成分的实施例包括大量不同的溶解于相同水溶液的成分，或大量不同的附着到固相载体的成分或在没有特定顺序上不同成分在空间上没有不同。混合物是无法定位的(addressable)。举例说明本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.11.15 US 12/946,7371.一种样品分析的方法，包括: 使包括以下的反应混合物: 用于扩增核酸靶的PCR试剂，以及 于所述核酸靶上进行活瓣切割分析的活瓣切割试剂，经受如下热循环条件: 第一组5-15个循环: 1.至少90°C的第一温度； i1.范围为60°C-75°C的第二温度；ii1.范围为65°C-75°C的第三温度；随后是: 第二组20-50个循环: 1.至少90°C的第四温度； ii.比所述第二温度低至少10°C的第五温度； ii1.范围为65°C -75°C的第六温度； 其中第一和第二组循环之间不向所述反应加入额外的试剂，并且，在第二组循环的每个循环中，测量活瓣探针的切割。2.权利要求1的方法，其中所述方法包括在所述反应混合物处于所述第五温度时测定所述活瓣探针的切割。3.权利要求1或2的方法，其中在所述20-50个循环的每个循环期间通过检测所述反应混合物的荧光测量所述活瓣探针的切割。4.权利要求1-3任一项的方法，其中: 所述PCR试剂包括:核酸模板；第一 PCR引物，第二 PCR引物，热稳定的聚合酶，和核苷酸；以及 所述活瓣切割试剂包括:侵入寡核苷酸，活瓣探针，热稳定的活瓣核酸内切酶和FRET盒， 其中所述第一 PCR引物和所述侵入寡核苷酸具有不同的核苷酸序列。5.权利要求1-3任一项的方法，其中: 所述PCR试剂包括:核酸模板,第一 PCR引物,第二 PCR引物,热...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·奥尔德姆霍汤姆，邹鸿志，G·P·利德高，M·J·多马尼科，H·阿拉维，
申请(专利权)人：精密科学公司，
类型：
国别省市：