一种枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法技术

本发明专利技术公开一种枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，包括如下步骤：1）提取待测枣树亲本和子代的基因组DNA；2）以亲本材料筛选SSR引物；3）分别利用上述SSR引物，各自以待测枣树亲本和子代的基因组DNA为模版，进行PCR扩增；4）利用生物学软件分析PCR扩增结果，构建枣树SSR标记分子遗传图谱。本发明专利技术建立了高效低成本的枣树SSR标记技术体系，获得的SSR标记和核心引物组，具有高效性、稳定性和共显性等优点。利用该套标记可以进行枣树遗传图谱构建、遗传多样性分析、品种鉴定和分子标记辅助育种等研究，推动枣树遗传学和育种技术的发展。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学、遗传学和基因组学领域，特别是指一种枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法。
技术介绍
枣树属于鼠李科枣属，是原产我国的特有果树，种质资源极其丰富，遗传背景复杂，迄今至少已有7000年的栽培历史。在长期的自然演化和人工选择过程中，形成了丰富的变异，至今已经发现和记载的枣树品种和优良类型达880多种。但是由于缺乏大量的多态性分子标记，其遗传学和基因组学方面的研究相对比较滞后。申莲英构建了第一个率树分子遗传图谱(申连英.2005.率(Ziziphus jujubaMill)遗传连锁图谱构建及性状的QTL定位研究)，包括分布在14个连锁群的333个AFLP(amplified fragment length polymorphism限制性片段长度多态性标记)标记，覆盖基因组长度1237.4cM，平均图距为3.9cM。齐靖等(齐靖，董祯，毛永民，等.枣高密度遗传图谱的构建与树干直径的QTL分析.林业科学，2009，45 (8):44-49)对该图谱进行加密至 388 个 AFLP 标记和 35 个 RAPD (random amplified polymorphic DNA 即随机扩增多态性DNA标记)标记由15个连锁群，覆盖基因组总长度1309.4cM，标记间平均距离3.1cM0但该图谱缺乏通用性的共显性标记，相对难以进行整合。因此，以共显性SSR标记构建框架遗传图谱，对枣树分子育种的发展具有重要的意义。RAPD、AFLP 和 SRAP(Sequence-related amplified polymorphism 即相关序列扩增多态性)标记等被用于枣树的品种分类和亲缘关系分析。但这些标记由于显性特点等原因，加上新的标记的出现，渐渐较少用于遗传图谱构建。SSR(Simple sequence repeat简单重复序列)标记，又叫微卫星(Microsatellites)标记,具有数量丰富、共显性、重复性、实验技术简便等突出的优点，因此越来越多的作为锚定标记被应用到众多物种的遗传图谱构建，尤其是框架遗传图谱构建。此外，SSR还被广泛应用于遗传多样性分析、指纹图谱、遗传图谱的构建中。本专利技术人利用磁珠富集法开发了冬枣SSR标记引物240对，筛选其中的多态引物构建枣树的分子遗传图谱，从而进行相关性状的QTL定位，可以推动枣树重要性状的遗传控制研究和分子标记辅助育种的进程。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法。一种枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤:I) DNA的提取:提取待测枣树亲本和子代的基因组DNA ；2) SSR标记引物的筛选:以亲本材料筛选SSR标记引物；3)PCR扩增:分别利用上述SSR标记引物，各自以待测枣树亲本和子代的基因组DNA为模版，进行PCR扩增；4)图谱构建:利用生物学软件分析PCR扩增结果，构建枣树SSR标记分子遗传图P曰。其中，所述步骤I)中所述待测枣树亲本是以冬枣为母本，以映山红为父本；所述子代为149株F1代的子代。其中，所述步骤I)中所述DNA的提取使用改良后的CTAB法，具体步骤如下:(I)取适量CTAB提取液放入65°C水浴锅中预热待用；(2)取枣树叶片0.5g，放入研钵中，加入少量PVP-40，在液氮中迅速研磨成粉末状，转移至装有lml65°C预热的CTAB提取液(用前加2% β -巯基乙醇混匀)的离心管中(用前做灭菌处理)；(3)将所述离心管旋涡剧烈振荡，充分混匀，放入65°C水浴锅中，水浴50min，每隔IOmin上下翻动离心管助充分混匀；(4) I2OOOrpm 常温下离心 IOmin ；(5)取上清液于新的离心管中(注意吸取时不要触及分界面，以免带入杂质)，加入等体积水饱和酚/氯仿/异戊醇混合液(25: 24: I)(现用现配)，轻轻颠倒混匀，室温放置IOmin ；(6) I2OOOrpm 常温下离心 I Omin ；(7)取步骤(6)所得上清液于新的离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24: I)再次抽提；(8)取步骤(7)所得上清液于新的离心管中，加等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，放置于_20°C冰箱中沉淀20min ；(9)挑出DNA絮状沉淀到2ml离心管中，用70%乙醇清洗沉淀2次，每次30min ；(10)在超净工作台中用无菌风吹干沉淀，加入100μ I TE缓冲液溶解DNA，于-20°C保存待用。其中，所述步骤2)中所述SSR引物的筛选基于磁珠富集法，开发冬枣SSR引物，利用母本冬枣和父本映山红进行SSR引物筛选，挑选母本冬枣和父本中至少一方表现为杂合的引物作为核心引物。其中，所述步骤2)中所述SSR引物如表3中所示的240对引物。其中，所述步骤2)中所述SSR引物如表3中所示的170对核心引物。其中，所述步骤2)还包括检测提取的DNA的质量。其中，所述步骤3)PCR扩增采用的是三引物法，即由在正向引物的5’端加上M13尾巴序列、特异反向引物以及带有荧光标记的通用型M13引物。其中，所述带有荧光标记的通用型Ml3引物如表I中所示。其中，所述步骤3) PCR扩增之后还包括对PCR扩增后的结果进行检测，采用毛细管电泳检测。其中,所述步骤4)中所述生物学软件为Genemarker V1.75软件,读取后的数据经过FlexiBinv2程序矫正后用于后续分析。其中，所述步骤4)中分别对PCR扩增结果进行X 2检验，分析其是否符合孟德尔分离定律，在5%的显著水平下找到偏分离标记并去除，分别将三种分离形式(I: 1、1: 2: 1、1:1:1:1)的标记类型转化为统一的格式，选用全同胞群体遗传图谱构建软件FslinkageMAP进行分子遗传图谱的构建。本专利技术的有益效果如下:1、提供了枣树的170对核心引物，建立了高效的枣树SSR标记分析技术体系。2、采用FslinkageMAP作图软件,能够利用Mapmaker和Joinmap不能利用的标记，提闻标记的利用效率。3、采用毛细管电泳SSR基因型分型技术，提高实验的效率和准确性。4、SSR标记分析过程中采用8 μ I的PCR扩增体系，降低实验成本。本专利技术利用磁珠富集法开发了冬枣SSR引物240对，筛选其中的SSR引物构建枣树的遗传图谱，从而进行相关性状的QTL定位，可以推动枣树重要性状的遗传控制研究和分子标记辅助育种的进程。附图说明图1为本专利技术实施例的率树SSR标记分子遗传图谱。具体实施例方式为使本专利技术要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将在具体实施例进行详细描述。如果没有特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域普通技术人员熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。本专利技术实施例提供的枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，包括:步骤I提取DNA所述枣树的基因组DNA提取方法，采用改良后的CTAB法，具体步骤如下:步骤11取适量CTAB提取液放入65 °C水浴锅中预热待用； 步骤12取枣树叶片0.5g，放入研钵中，加入少量PVP-40，在液氮中迅速研磨成粉末状，转移至装有lml65°C预热的CTAB提取液(用前加2% β -巯基乙醇混匀)的离心管中(用前做灭菌处理)；步骤13旋涡剧烈振荡，充分混匀，放入65°C水浴锅中，水浴50min，每本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1）DNA的提取：提取待测枣树亲本和子代的基因组DNA；2）SSR标记引物的筛选：以亲本材料筛选SSR标记引物；3）PCR扩增：分别利用上述SSR标记引物，各自以待测枣树亲本和子代的基因组DNA为模版，进行PCR扩增；4）图谱构建：利用生物学软件分析PCR扩增结果，在5%的显著水平下下找到偏分离标记并去除，构建枣树SSR标记分子遗传图谱。

【技术特征摘要】
1.一种枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)DNA的提取:提取待测枣树亲本和子代的基因组DNA ； 2)SSR标记引物的筛选:以亲本材料筛选SSR标记引物； 3)PCR扩增:分别利用上述SSR标记引物，各自以待测枣树亲本和子代的基因组DNA为模版，进行PCR扩增； 4)图谱构建:利用生物学软件分析PCR扩增结果，在5%的显著水平下下找到偏分离标记并去除,构建枣树SSR标记分子遗传图谱。2.根据权利要求1所述的枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤I)中所述待测枣树亲本是以冬枣为母本，以映山红为父本；所述子代为149株F1代的子代。3.根据权利要求1所述的枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤I)中所述DNA的提取使用改良后的CTAB法，具体步骤如下: (1)取适量CTAB提取液放入65°C水浴锅中预热待用； (2)取枣树叶片0.5g，放入研钵中，加入少量PVP-40，在液氮中迅速研磨成粉末状，转移至装有lml65°C预热的CTAB提取液的离心管中； (3)旋涡剧烈振荡，充分混匀，放入65°C水浴锅中，水浴50min，每隔IOmin上下翻动离心管，充分混勻； (4)12000rpm 常温下离心 IOmin ； (5)取上清液于新的离心 管中，加入等体积水饱和酚/氯仿/异戊醇混合液，其配比为25:24:1，轻轻颠倒混匀，室温放置IOmin ； (6)12000rpm 常温下离心 IOmin ； (7)取步骤(6)所得上清液于新的离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，其配比为24:1，再次抽提； (8)取步骤(7)所得上清液于新的离心管中，加等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，放置于_20°C冰箱中沉淀20min ； (9)挑出DNA絮状沉淀到2ml离心管中，用70%乙醇清洗沉淀2次...

【专利技术属性】
技术研发人员：庞晓明，王斯琪，李颖岳，刘君，续九如，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：