结构和温度依赖性瓣状核酸内切酶底物制造技术

用于例如通过温度移动可逆抑制瓣状核酸内切酶切割的5'发夹寡核苷酸底物和使用5'发夹寡核苷酸的方法。夹寡核苷酸的方法。夹寡核苷酸的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】结构和温度依赖性瓣状核酸内切酶底物
[0001]本申请要求于2019年9月16日提交的美国临时申请序列号62/901,085的优先权，所述申请以引用方式并入本文。


[0002]本专利技术涉及瓣状核酸内切酶和使用核酸底物中的结构调节这些酶的酶促活性，所述结构在较低温度下阻遏报告切割位点处的酶促切割并且在升高的温度下改变结构以允许报告切割位点处的底物切割。

技术介绍

[0003]真细菌(Eubacteria)、真核生物(Eukarya)和古细菌(Archaea)包含具有5'核酸外切酶和核酸内切酶功能、参与DNA修复的酶。例如，在真细菌中的DNA聚合酶I(DNA Pol I)的5'
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核酸外切酶结构域中以及在真核生物和古细菌生物体的FEN
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1蛋白中发现了这些酶促活性。这些酶识别并切割包含双链和单链区域的多种核酸结构，优选的结构是由上游链3'端的模板化聚合酶延伸形成的置换5'链。包含与具有3'末端的上游链碱基配对且与具有单链5'瓣的下游链碱基配对的模板链的所得结构可称为瓣结构，并且识别并切割所述结构的酶通常本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种组合物，其包含用于与核酸分子一起形成侵入性切割结构的寡核苷酸5'发夹报告基因，所述侵入性切割结构具有靶切割位点，所述5'发夹报告基因包含5'发夹形成区、下游双链茎以及与所述核酸分子的3'末端部分互补的3'部分，其中所述核酸分子的所述3'末端部分退火到所述5'发夹报告基因的所述3'部分上，形成侵入性切割结构的上游双链体。2.如权利要求1所述的组合物，其中所述侵入性切割结构可在所述靶切割位点被Mg
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瓣测定缓冲液中的Afu FEN
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1切割。3.如权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述靶切割位点位于所述5'发夹报告基因的所述下游双链茎中。4.如权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述下游双链茎是包含环的发夹茎。5.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其还包含核酸分子，所述核酸分子包含与所述5'发夹报告基因的所述3'部分互补的3'末端部分。6.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述5'发夹报告基因包含FRET标记系统。7.如权利要求6所述的组合物，其中FRET标记系统的第一成员附接在所述5'发夹报告基因上的第一位置，并且FRET标记系统的第二成员附接在所述5'发夹报告基因上的第二位置，其中所述靶切割位点在所述第一位置与所述第二位置之间。8.如权利要求7所述的组合物，其中所述第一位置和所述第二位置沿所述5'发夹报告基因的长度间隔不超过20个寡核苷酸，优选不超过10个寡核苷酸，更优选不超过9、8、7、6、5、4或3个寡核苷酸。9.如权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述5'发夹报告基因还包含3'阻断剂。10.如权利要求9所述的组合物，其中所述3'阻断剂选自3'胺、3'磷酸酯、3'生物素、3'己二醇和3'双脱氧核苷酸。11.如权利要求1至10中任一项所述的组合物，其还包含有包含阳离子的缓冲溶液。12.如权利要求11所述的组合物，其中所述包含阳离子的缓冲溶液是Mg
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瓣测定缓冲液。13.如权利要求1至12中任一项所述的组合物，其还包含瓣状核酸内切酶。14.如权利要求13所述的组合物，其中所述瓣状核酸内切酶包含FEN
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1核酸内切酶，优选热稳定FEN
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1核酸内切酶，更优选来自古细菌生物体的热稳定FEN
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1核酸内切酶。15.如权利要求12所述的组合物，其中所述FEN
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1核酸内切酶包含Afu FEN
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1、Ave FEN
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1和Pfu FEN
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1中的一种或多种。16.如权利要求1至15中任一项所述的组合物，其还包含一种或多种PCR
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瓣测定试剂。17.如权利要求16所述的组合物，其中所述PCR
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瓣测定试剂包含以下中的一种或多种：
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DNA聚合酶；
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脱氧核苷三磷酸；
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瓣状寡核苷酸；
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引物。18.如权利要求1至16中任一项所述的组合物，其还包含靶核酸。19.一种方法，其包括：
i)提供a)用于与核酸分子一起形成侵入性切割结构的寡核苷酸5'发夹报告基因，所述侵入性切割结构具有靶切割位点；和b)核酸分子；其中所述5'发夹报告基因包含5'发夹形成区、下游双链茎以及与所述核酸分子的3'末端部分互补的3'部分，并且其中所述核酸分子的所述3'末端部分退火到所述5'发夹报告基因的所述3'部分上形成侵入性切割结构的上游双链体；和ii)将所述核酸分子的所述3'末端部分退火到所述5'发夹报告基因的所述3'部分上。20.如权利要求19所述的方法，其中所述侵入性切割结构可在所述靶切割位点被Mg
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瓣测定缓冲液中的Afu FEN
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1切割。21.如权利要求19或权利要求20所述的方法，其中所述靶切割位点位于所述5'发夹报告基因的所述下游双链茎中。22.如权利要求19至21中任一项所述的方法，其中所述下游双链茎是包含环的发夹茎。23.如权利要求19至22中任一项所述的方法，其中所述5'发夹报告基因包含FRET标记系统。24.如权利要求23所述的方法，其中FRET标记系统的第一成员附接在所述5'发夹报告基因上的第一位置，并且FRET标记系统的第二成员附接在所述5'发夹报告基因上的第二位置，其中所述靶切割位点在所述第一位置与所述第二位置之间。25.如权利要求24所述的方法，其中所述第一位置和所述第二位置沿所述5'发夹报告基因的长度间隔不超过20个寡核苷酸，优选不超过10个寡核苷酸，更优选不超过9、8、7、6、5、4或3个寡核苷酸。26.如权利要求19至25中任一项所述的方法，其中所述5'发夹报告基因还包含3'阻断剂。27.如权利要求26所述的方法，其中所述3'阻断剂选自3'胺、3'磷酸酯、3'生物素、3'己二醇和3'双脱氧核苷酸。28.如权利要求19所述的方法，其还包括在反应混合物中切割所述侵入性切割结构。29.如权利要求28所述的方法，其中所述反应混合物包含Mg
++
瓣测定缓冲液。30.如权利要求28或权利要求29所述的方法，其中所述反应混合物包含瓣状核酸内切酶。31.如权利要求30所述的方法，其中所述瓣状核酸内切酶包含FEN
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1核酸内切酶，优选热稳定FEN
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1核酸内切酶，更优选来自古细菌生物体的热稳定FEN
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1核酸内切酶。32.如权利要求31所述的方法，其中所述FEN
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1核酸内切酶包含Afu FEN
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1、Ave FEN
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1和Pfu FEN
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1中的一种或多种。33.如权利要求28至32中任一项所述的方法，其中所述反应混合物包含一种或多种PCR
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瓣测定试剂。34.如权利要求33所述的方法，其中所述PCR
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瓣测定试剂包含以下中的一种或多种：
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DNA聚合酶；
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脱氧核苷三磷酸；
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瓣状寡核苷酸；
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引物。35.如权利要求28至34中任一项所述的方法，其还包含靶核酸。36.一种组合物，其包含用于形成具有靶切割位点的侵入性切割结构的寡核苷酸5'发夹测试底物，所述5'发夹测试底物包含5'瓣、下游双链茎和上游双链茎，从而限定可在所述靶切割位点被Mg
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瓣测定缓冲液中的Afu FEN
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1核酸内切酶切割的侵入性切割结构，其中所述5'瓣包含发夹形成区，并且其中所述发夹形成区中发夹的形成抑制所述5'发夹测试底物在所述靶切割位点处的FEN
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1核酸内切酶切割。37.如权利要求36所述的组合物，其中所述靶切割位点位于所述5'发夹测试底物的所述下游双链茎中。38.如权利要求36或权利要求37所述的组合物，其中所述下游双链茎是包含环的发夹茎。39.如权利要求36至38中任一项所述的组合物，其中所述5'发夹测试底物包含FRET标记系统。40.如权利要求39所述的组合物，其中FRET标记系统的第一成员附接在所述5'发夹测试底物上的第一位置，并且FRET标记系统的第二成员附接在所述5'发夹测试底物上的第二位置，其中所述靶切割位点在所述第一位置与所述第二位置之间。41.如权利要求40所述的组合物，其中所述第一位置和所述第二位置沿所述5'发夹测试底物的长...

【专利技术属性】
技术研发人员：Z加拉特，MB马特，NJ多米尼克，MJ多米尼克，
申请(专利权)人：精密科学公司，
类型：发明
国别省市：