一种识别生物个体或对生物个体进行亲缘鉴定的方法和试剂盒技术

本申请涉及含有单核苷酸多态性(SNP)位点的核酸分子的多重、不对称扩增。特别地，通过同时、不对称扩增来源于生物个体的含有SNP位点的核酸分子，本申请提供了一种识别生物个体或对生物个体进行亲缘鉴定的方法以及试剂盒。对生物个体进行亲缘鉴定的方法以及试剂盒。对生物个体进行亲缘鉴定的方法以及试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
一种识别生物个体或对生物个体进行亲缘鉴定的方法和试剂盒


[0001]本申请涉及含有单核苷酸多态性(SNP)位点的核酸分子的多重、不对称扩增。特别地，通过同时、不对称扩增来源于生物个体的含有SNP位点的核酸分子，本申请提供了一种识别生物个体或对生物个体进行亲缘鉴定的方法以及试剂盒。

技术介绍

[0002]随着各方面对司法诉讼活动的科学性、准确性及客观性要求的不断提高，以及物证鉴定领域的不断发展，对案件中检材个体来源的要求也随之提高。通常，对遗传物质DNA进行检验，通过检验其序列的多态性及长度的多态性，就可以实现个体的识别及亲权的鉴定。由于检测结果的准确性及可靠性较佳，DNA分析目前已经成为物证鉴定领域的重要技术手段。
[0003]目前，法医DNA鉴定主要采用PCR
‑
STR分型技术对未知个体来源的检材进行基于STR(short tandem repeat，短串联重复序列)位点的分型。但是，由于各STR位点长度不一，往往需要扩增达400bp的产物，并且，在实际案件中常会遇到各种因素导致检材降解严重，而PCR
‑
STR分型技术对这些检材进行检测时，常出现“优势扩增”或“无效扩增”，导致片段较大的STR基因座无法有效分型，从而导致错误的分型结果。此外，基于STR的分型技术一直依赖各式PCR后处理技术，而目前主要是基于PCR产物的毛细管电泳，但这种开盖的分析方法有引起实验室污染的风险，并且操作复杂、耗时较长，同时受到特殊仪器的限制。因此，PCR
‑
STR分型技术并不能满足目前法医DNA鉴定的发展需要。
[0004]SNP(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)是目前为止人类基因组中分布最广泛、存在数量最多的DNA遗传多态性，占所有已知多态性的90％以上，平均500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多，比STR高出几个数量级。由于SNP主要为二等位基因多态性，其突变率低，比STR更加稳定可靠，且检测SNP所需要扩增的PCR产物更短，更适合于法医DNA鉴定中降解的检材。然而，SNP分型技术尚未在法医鉴定中广泛应用，主要原因包括：1)SNP识别率比STR低，需要检测多个高度多态性的SNP才能满足个体识别的需要；2)SNP在不同国家和民族发生率差异较大，同一组SNP对不同人群的个体识别能力有差异；3)缺乏简便、快速、易于自动化的SNP检测技术平台。
[0005]综上，如何建立一种简便、快速、易于自动化的SNP检测体系，且可对痕量、降解检材的DNA同时进行个体识别和亲权鉴定，为法医DNA分析提供有力的技术支撑，成为亟待解决的问题。

技术实现思路

[0006]在本专利技术中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本专利技术，下面提供相关术语的定义和解释。
[0007]如本文中所使用的，术语“SNP(单核苷酸多态性)”是指在基因组水平上由单个核
苷酸的变异所引起的核酸序列多态性。基因组中具有单核苷酸多态性的位点即称为“SNP位点”。在本文中，SNP位点通过其参考号(例如rs ID)命名。可以利用rs ID在公共数据库中查询SNP位点及其型别，例如，通过NCBI的dbSNP数据库，ChinaMAP数据库，JSNP数据库等。
[0008]如本文中所使用的，术语“亲权鉴定”或“亲缘鉴定”二者表示相同的含义，可以互换使用。其是指，利用生物的遗传标记的监测与分析，判定父代与子代之间的关系。在人类的亲权鉴定中，分为常规亲权鉴定(例如，父母子的鉴定)、隔代亲权鉴定(例如，祖父母和孙子/女的鉴定)和疑难的亲权鉴定(例如，表兄妹，父母皆疑的同胞的鉴定)。
[0009]如本文中所使用的，术语“个体识别率(Power of discrimination,DP)”是指在群体中随机抽取的两个个体，二者的遗传标记不相同的概率。
[0010]如本文中所使用的，术语“三联体”是指父、母和子三方，“三联体非父排除率”是指通过检测遗传标记，能够将不是孩子亲生父亲/母亲的个体排除的概率。
[0011]如本文中所使用的，术语“互补”意指，两条核酸序列能够根据碱基配对原则(Waston
‑
Crick原则)在彼此之间形成氢键，并由此形成双链体。在本申请中，术语“互补”包括“实质上互补”和“完全互补”。如本文中所使用的，术语“完全互补”意指，一条核酸序列中的每一个碱基都能够与另一条核酸链中的碱基配对，而不存在错配或缺口。如本文中所使用的，术语“实质上互补”意指，一条核酸序列中的大部分碱基都能够与另一条核酸链中的碱基配对，其允许存在错配或缺口(例如，一个或数个核苷酸的错配或缺口)。通常，在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下，“互补”(例如实质上互补或完全互补)的两条核酸序列将选择性地/特异性地发生杂交或退火，并形成双链体。相应地，术语“不互补”意指，两条核酸序列在允许核酸杂交、退火或扩增的条件下不能发生杂交或退火，无法形成双链体。如本文中所使用的，术语“不能完全互补”意指，一条核酸序列中的碱基不能够与另一条核酸链中的碱基完全配对，至少存在一个错配或缺口。
[0012]如本文中所使用的，术语“杂交”和“退火”意指，互补的单链核酸分子形成双链核酸的过程。在本申请中，“杂交”和“退火”具有相同的含义，并且可互换使用。通常，完全互补或实质上互补的两条核酸序列可发生杂交或退火。两条核酸序列发生杂交或退火所需要的互补性取决于所使用的杂交条件，特别是温度。
[0013]如本文中所使用的，术语“PCR反应”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指使用核酸聚合酶和引物来扩增靶核酸的反应(聚合酶链式反应)。如本文中所使用的，术语“多重扩增”是指，在同一个反应体系中对多个靶核酸进行扩增。如本文中所使用的，术语“不对称扩增”是指，对靶核酸进行扩增所获得的扩增产物中，两条互补的核酸链的量不相同，一条核酸链的量大于另一条核酸链。
[0014]如本文中所使用的，并且如本领域技术人员通常理解的，术语“正向”和“反向”仅仅是为了便于描述和区分一个引物对中的两条引物；它们是相对而言的，并不具有特别的含义。
[0015]如本文中所使用的，术语“熔解曲线分析”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指，通过测定双链核酸分子的熔解曲线来分析双链核酸分子存在或其身份(identity)的方法，其通常用于评估双链核酸分子在加热过程中的解离特征。用于进行熔解曲线分析的方法是本领域技术人员熟知的(参见例如The Journal of Molecular Diagnostics 2009,11(2):93
‑
101)。在本申请中，术语“熔解曲线分析”和“熔解分析”具有相同的含义，并
且可互换使用。
[0016]在本申请的某些优选实施方案中，可通过使用标记有报告基团和淬灭基团的检测探针来进行熔解曲线分析。简言之，在环境温度下，检测探针能本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种识别生物个体或对生物个体进行亲缘鉴定的方法:(a)针对每一个待分析的个体，提供来源于所述个体的含有一种或多种靶核酸的样品，所述靶核酸包含一种或多种SNP位点，并且，提供第一通用引物和第二通用引物，并且，针对每一种SNP位点，提供至少一个靶特异性引物对；其中，所述第一通用引物包含第一通用序列；所述第二通用引物包含第二通用序列，所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含至少一个核苷酸；所述靶特异性引物对能够以所述靶核酸为模板进行扩增，产生含有所述SNP位点的核酸产物，并且所述靶特异性引物对包含一个正向引物和一个反向引物，其中，所述正向引物包含第一通用序列和特异于所述靶核酸的正向核苷酸序列，且所述正向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；所述反向引物包含第二通用序列和特异于所述靶核酸的反向核苷酸序列，且所述反向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；并且，第二通用序列不能与所述正向引物的互补序列完全互补；和(b)在允许核酸扩增的条件下，使用所述第一通用引物和第二通用引物以及所述靶特异性引物对，通过PCR反应分别扩增各个样品中的靶核酸，从而获得分别与各个个体对应的扩增产物；(c)对步骤(b)获得的与各个个体对应的扩增产物分别进行熔解曲线分析；(d)根据步骤(b)的熔解曲线分析结果，对生物个体进行识别或判断个体间的亲缘关系。2.权利要求1的方法，所述生物个体选自动物个体，例如哺乳动物个体，例如人类个体；优选地，所述SNP位点为人基因组中的SNP位点；例如所述靶核酸包含选自下列的人基因组SNP位点：rs6424243，rs12990278，rs2122080，rs98506667，rs774763，rs10779650，rs4971514，rs711725，rs2053911，rs9613776，rs7160304，rs1024676，rs1560193，rs10004744，rs6792367，rs11856699，rs1561393，rs10820181，rs6504977，rs8027171，rs1110116，rs9621748，rs32853，rs4847034，rs2826949，rs8103778，rs1396009，rs1523537，rs1528460，rs7937238，rs2111980，rs7278737，rs591173，rs1358856，rs2730648，rs859400，rs876724，rs2270529，rs1463729，rs6857303，rs214955，rs7041158，rs6474513，rs964681，rs2237427，rs590162，rs560681，rs2342747，rs4796362，rs9307465，rs4288409，rs1027895，rs10098647，rs116187，rs7704770，rs2272998，rs901398，rs727811，rs3802268，rs1001389，rs4237677，rs1355366，rs3900，rs1019029，rs938283，rs464663，rs10776839，rs12997453，rs4606077，rs914165，rs722098，rs7104420，以及前述SNP位点的任意组合(例如，前述SNP位点中任意20个，30个，40个，50个，60个，70个的组合)；优选地，所述样品中的靶核酸包含下列人基因组SNP位点：rs6424243，rs12990278，rs2122080，rs98506667，rs774763，rs10779650，rs4971514，rs711725，rs2053911，rs9613776，rs7160304，rs1024676，rs1560193，rs10004744，rs6792367，rs11856699，rs1561393，rs10820181，rs6504977，rs8027171，rs1110116，rs9621748，rs32853，rs4847034，rs2826949，rs8103778，rs1396009，rs1523537，rs1528460，rs7937238，rs2111980，rs7278737，rs591173，rs1358856，rs2730648，rs859400，rs876724，rs2270529，
rs1463729，rs6857303，rs214955，rs7041158，rs6474513，rs964681，rs2237427，rs590162，rs560681，rs2342747，rs4796362，rs9307465，rs4288409，rs1027895，rs10098647，rs116187，rs7704770，rs2272998，rs901398，rs727811，rs3802268，rs1001389，rs4237677，rs1355366，rs3900，rs1019029，rs938283，rs464663，rs10776839，rs12997453，rs4606077，rs914165，rs722098和rs7104420。3.权利要求1或2的方法，在步骤(a)中，针对每一种SNP位点，还提供一个检测探针，所述检测探针包含特异于所述靶核酸的核苷酸序列并且能够与所述靶核酸中含有所述SNP位点的区域退火或杂交，并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；并且，在步骤(c)中，使用所述检测探针对步骤(b)获得的与各个个体对应的扩增产物分别进行熔解曲线分析；优选地，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：(1)在步骤(b)中，将所述样品与所述第一通用引物、所述第二通用引物和所述靶特异性引物对，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，将检测探针加入到步骤(b)的产物中，并进行熔解曲线分析；或者，在步骤(b)中，将所述样品与所述第一通用引物、所述第二通用引物、所述靶特异性引物对和所述检测探针，以及核酸聚合酶混合，并进行PCR反应，然后，在PCR反应结束后，进行熔解曲线分析；(2)所述检测探针包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(PNA)或锁核酸)，或其任何组合组成；(3)所述检测探针的长度为15
‑
20nt，20
‑
30nt，30
‑
40nt，40
‑
50nt，50
‑
60nt，60
‑
70nt，70
‑
80nt，80
‑
90nt，90
‑
100nt，100
‑
200nt，200
‑
300nt，300
‑
400nt，400
‑
500nt，500
‑
600nt，600
‑
700nt，700
‑
800nt，800
‑
900nt，900
‑
1000nt；(4)所述检测探针具有3'
‑
OH末端；或者，所述检测探针的3'
‑
末端是封闭的；例如，通过在检测探针的最后一个核苷酸的3'
‑
OH上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，通过将检测探针的最后一个核苷酸的3'
‑
OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'
‑
末端；(5)所述检测探针为自淬灭探针；例如，所述检测探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团；优选地，所述报告基团和淬灭基团相距10
‑
80nt或更长的距离；(6)所述检测探针中的报告基团为荧光基团(例如，ALEX
‑
350,FAM,VIC,TET,CAL Fluor Gold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red 590,ROX,CAL Fluor Red 610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705)；并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如DABCYL、BHQ(例如BHQ
‑
1或者BHQ
‑
2)、ECLIPSE、和/或TAMRA)；(7)所述检测探针具有抵抗核酸酶活性(例如5'核酸酶活性，例如5'至3'核酸外切酶活性)的抗性；例如，所述检测探针的主链包含抵抗核酸酶活性的修饰，例如硫代磷酸酯键，烷基磷酸三酯键，芳基磷酸三酯键，烷基膦酸酯键，芳基膦酸酯键，氢化磷酸酯键，烷基氨基磷
酸酯键，芳基氨基磷酸酯键，2'
‑
O
‑
氨基丙基修饰，2'
‑
O
‑
烷基修饰，2'
‑
O
‑
烯丙基修饰，2'
‑
O
‑
丁基修饰，和1
‑
(4'
‑
硫代
‑
PD
‑
呋喃核糖基)修饰；(8)所述检测探针是线性的，或者具有发夹结构；(9)所述检测探针各自独立地具有相同或不同的报告基团；优选地，所述检测探针具有相同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；或，所述检测探针具有不同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据报告基团的信号种类及熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；(10)在步骤(c)中，对步骤(b)的产物进行逐渐的升温或降温并实时监测每一种检测探针上的报告基团发出的信号，从而获得每一种报告基团的信号强度随着温度变化而变化的曲线；然后，对所述曲线进行求导，从而获得步骤(b)的产物的熔解曲线；(11)根据熔解曲线中的熔解峰(熔点)，确定各个SNP位点的型别；(12)所述检测探针包括具有选自下列的核苷酸序列的检测探针或其任何组合(例如，任意20个，30个，40个，50个，60个，70个的组合)：SEQ ID NO:3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，51，54，57，60，63，66，69，72，75，78，81，84，87，90，93，96，99，102，105，108，111，114，117，120，123，126，129，132，135，138，141，144，147，150，153，159，162，165，168，171，174，177，180，183，186，189，192，195，198，201，204，207，210，213和216。4.权利要求1
‑
3任一项的方法，其中，在所述方法的步骤(d)中，根据熔解曲线分析结果确定每一个生物个体的各个SNP位点型别，进而对生物个体进行识别或判断个体间的亲缘关系；优选地，在所述方法的步骤(d)中，根据熔解曲线分析结果确定每一个生物个体的各个SNP位点型别，并将其与参照数据库进行比较，从而对生物个体进行识别；或者，在所述方法的步骤(d)中，根据熔解曲线分析结果确定每一个生物个体的各个SNP位点型别，并将两个或更多个生物个体的SNP位点型别进行比较，从而确定所述两个或更多个生物个体亲缘关系。5.权利要求1
‑
4任一项的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：(1)所述样品包含1
‑
5个，5
‑
10个，10
‑
15个，15
‑
20个，20
‑
50个或更多个靶核酸；(2)所述靶核酸包含1
‑
5个，5
‑
10个，10
‑
15个，15
‑
20个，20
‑
50个或更多个SNP位点；(3)所述样品包含来源于所述个体的基因组核酸或其片段，例如基因组DNA或其片段；(4)在所述方法的步骤(a)中，提供1
‑
5个，5
‑
10个，10
‑
15个，15
‑
20个，20
‑
50个或更多个靶特异性引物对；(5)在所述方法的步骤(b)中，所述第一通用引物和第二通用引物的工作浓度高于所述正向引物和反向引物的工作浓度；例如，所述第一通用引物和第二通用引物的工作浓度比所述正向引物和反向引物的工作浓度高1
‑
5倍，5
‑
10倍，10
‑
15倍，15
‑
20倍，20
‑
50倍或更多倍；(6)在所述方法的步骤(b)中，所述第一通用引物和第二通用引物的工作浓度是相同的；或者，所述第一通用引物的工作浓度低于第二通用引物；(7)在所述方法的步骤(b)中，所述正向引物和反向引物的工作浓度是相同的或者不同的；
(8)所述样品或靶核酸包含mRNA，且在进行所述方法的步骤(b)之前，对所述样品进行逆转录反应；和(9)在所述方法的步骤(b)中，使用核酸聚合酶(特别是模板依赖性核酸聚合酶)来进行PCR反应；优选地，所述核酸聚合酶为DNA聚合酶，例如热稳定的DNA聚合酶；优选地，所述热稳定的DNA聚合酶获自，Thermus aquaticus(Taq),Thermus thermophiles(Tth),Thermus filiformis,Thermis flavus,Thermococcus literalis,Thermus antranildanii,Thermus caldophllus,Thermus chliarophilus,Thermus flavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermus oshimai,Thermus ruber,Thermus rubens,Thermus scotoductus,Thermus silvanus,Thermus thermophllus,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosipho africanus,Thermococcus litoralis,Thermococcus barossi,Thermococcus gorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcus horikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictium occultum,Aquifexpyrophilus和Aquifex aeolieus；优选地，所述DNA聚合酶为Taq聚合酶。6.权利要求1
‑
5任一项的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：(1)所述第一通用引物由第一通用序列组成，或者，包含第一通用序列和额外的序列，所述额外的序列位于第一通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1
‑
5个，5
‑
10个，10
‑
15个，15
‑
20个或更多个核苷酸；(2)所述第一通用序列位于或构成所述第一通用引物的3'部分；(3)所述第一通用引物的长度为5
‑
15nt，15
‑
20nt，20
‑
30nt，30
‑
40nt，或40
‑
50nt；(4)所述第一通用引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；(5)所述第二通用引物由第二通用序列组成，或者，包含第二通用序列和额外的序列，所述额外的序列位于第二通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1
‑
5个，5
‑
10个，10
‑
15个，15
‑
20个或更多个核苷酸；(6)所述第二通用序列位于或构成所述第二通用引物的3'部分；(7)所述第二通用序列包含第一通用序列且在第一通用序列的3'端额外包含1
‑
5个，5
‑
10个，10
‑
15个，15
‑
20个或更多个核苷酸；(8)所述第二通用引物的长度为8
‑
15nt，15
‑
20nt，20
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30nt，30
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40nt，或40
‑
50nt；和(9)所述第二通用引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成。7.权利要求1
‑
6任一项的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：(1)在所述正向引物中，所述正向核苷酸序列直接连接至第一通用序列的3'端，或者，通过核苷酸连接体连接至第一通用序列的3'端；优选地，所述核苷酸连接体包含1
‑
5个，5
‑
10个，10
‑
15个，15
‑
20个或更多个核苷酸；(2)所述正向引物还包含额外的序列，其位于第一通用序列的5'端；优选地，所述额外的序列包含1
‑
5个，5
‑
10个，10
‑
15个，15
‑
20个或更多个核苷酸；(3)所述正向引物从5'至3'包含或由第一通用序列和正向核苷酸序列组成；或者，从5'至3'包...

【专利技术属性】
技术研发人员：李庆阁，黄秋英，郑佳豪，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：