一种冻存脐带血Treg细胞的体外扩增方法技术

本发明专利技术公开了一种冻存脐带血Treg细胞的体外扩增方法，采用冻存脐带血，在CBMC分离和CD4

An in vitro expansion method of cryopreserved cord blood Treg cells

【技术实现步骤摘要】
一种冻存脐带血Treg细胞的体外扩增方法


[0001]本专利技术涉及脐带血体外扩增方法，尤其是一种冻存脐带血Treg细胞的体外扩增方法。

技术介绍

[0002]调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)是一类具有免疫抑制作用的T淋巴细胞亚群，是维持机体免疫耐受的重要调控者。机体内CD4
+
CD25
+
Treg细胞仅占CD4
+
T细胞的5～10％，占人外周血单个核细胞只有1～2％。为了获得足量临床应用的细胞，需要在体外大量扩增Treg细胞。目前体外扩增获得Treg细胞的一般方法是将新鲜脐带血或外周血通过淋巴细胞分离液分离获得单个核细胞，再将单个核细胞进行磁分选获得CD4
+
CD25
+
Treg细胞，在细胞激活扩增过程中添加细胞因子IL
‑
2、anti
‑
CD3/anti
‑
CD28磁珠或单独的anti
‑
CD3、anti
‑
CD28，在Treg细胞激活本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种冻存脐带血Treg细胞的体外扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)复苏冻存脐带血，将融化的脐带血通过Ficoll分离方法获得单个核细胞，将单个核细胞进行磁分选获得CD4
+
CD25
+
CD127
low Treg细胞；流式检测CD4
+
CD25
+
Treg细胞的比例，若CD4
+
CD25
+
Treg细胞比例大于80％则进行下一步实验；(2)Treg细胞激活扩增，包括以下步骤：将Treg细胞用RPMI
‑
1640培养基以(3
‑
8)
×
105/mL重悬，RPMI
‑
1640培养基添加终浓度为5％
‑
10％FBS、200
‑
1000IU/mL IL
‑
2、50
‑
150nM雷帕霉素、10
‑
50μL/mL CD3/CD28/CD2可溶性T细胞激活剂；培养至第3天，离心收集细胞进行去激活培养，第3天RPMI
‑
1640培养基含5％
‑
10％FBS、200
‑
1000IU/mL IL
‑
2；第5天，离心收集细胞补充新鲜培养基，新鲜培养基RPMI
‑
1640培养基含5％
‑
10％FBS、200
‑
1000IU/mL IL
‑
2、50
‑
150nM雷帕霉素；第7天，离心收集细胞补充新鲜培养基，新鲜培养基RPMI
‑
1640培养基含5％
‑
10％FBS、200
‑
1000IU/mL IL
‑
2；培养第10天，补充新鲜培养基RPMI
‑
1640培养基含5％
‑
10％FBS、200
‑
1000IU/mL IL
‑
2；第12天离心收集细胞进行重激活培养，第12天的RPMI
‑
1640培养基含5％
‑
10％FBS、200
‑
1000IU/mL IL
‑
2、50
‑
150nM雷帕霉素、10
‑
50μL/mL CD3/CD28/CD2可溶性T细胞激活剂；第15天离心收集细胞去激活培养，RPMI
‑
1640培养基含5％
‑
10％FBS、200
‑
1000IU/mL IL
‑
2；分别在17天，19天补充新鲜培养基，RPMI
‑
1640培养基含5％
‑
10％FBS、200
‑
1000IU/mL IL
‑
2；培养至21天收获细胞，进行Treg细胞数量、活力、纯度、细胞杂质残留及淋巴细胞增殖抑制活性检测，如果7
‑
AAD
‑
细胞比例大于90％，CD4
+
CD25
+
FoxP3

【专利技术属性】
技术研发人员：张宇，张华，杜为，贺雪萍，张亚斌，张勇，杨俊晔，韩俊领，杨文玲，
申请(专利权)人：协和干细胞基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：