本发明专利技术属于生物技术检测领域，具体涉及一种快速鉴定鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒。所述试剂盒中包括flhB基因检测引物，所述flhB基因检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。本发明专利技术的试剂盒能快速高通量鉴定鸡白痢/伤寒沙门菌，可作为沙门菌传统血清学分型的辅助方法，并为鸡白痢/伤寒沙门菌的监测与实验室诊断提供了一种简单快速、重复性好的新方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术检测领域，具体涉及一种快速鉴定鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒。
技术介绍
沙门菌病是公共卫生学上有重要意义的传染病之一，其病原沙门菌属于肠杆菌科，蛋、家畜和肉制品是主要传播媒介，可引起多种畜禽疾病，造成全身性败血症和肠炎。鸡白痢和鸡伤寒分别是由鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌引起的，鸡白痢沙门菌主要感染2～3周龄的雏鸡，引起白色下痢，病死率较高，而成年鸡感染后病死率较低，但可长期带毒排毒。鸡伤寒沙门菌对雏鸡、成年鸡均可致病，以引起贫血、白细胞增多、出血为特征。因而，鸡白痢/伤寒沙门菌是我国养鸡业中危害严重的细菌。目前，根据Kauffman-White(K-W)血清型分型方法，依据沙门菌菌体抗原及鞭毛抗原的不同，沙门菌目前的血清型有2600种以上，中国已报道了292种不同的血清型，分属于35个O群。传统的检测方法即非选择性和选择性增菌、生化特性及血清学鉴定很费力、耗时，需4-7天才能完成，其它如抗体检测法，虽然快速，但其高假阳性使之不适于常规检测。因此，急需一些快速、特异、敏感的检测方法，以及时发现鸡白痢和鸡伤寒沙门菌，这对于鸡白痢和鸡伤寒的有效防控意义重大。
技术实现思路
针对现有技术中所存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种快速鉴定鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒及其制备和应用。为了实现上述目的及其他相关目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种快速鉴定鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括flhB基因检测引物，所述flhB基因检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。本专利技术的试剂盒采用PCR检测技术进行flhB基因检测，根据扩增及检测情况可分析判断检测对象是否属于鸡白痢/伤寒沙门菌。因此，引物的设计是本专利技术试剂盒的关键。基于本专利技术所述试剂盒是采用PCR技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：无菌水(ddH2O)、dNTP、PCR buffer、rTaq酶、样品基因组DNA提取试剂等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。本专利技术的试剂盒，可以是含有独立包装的引物对，也可以是含有配置好的含有引物对的PCR检测液。所述PCR检测液可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用PCR检测液加入引物获得。例如，所述试剂盒中还可以含有无菌水(ddH2O)、dNTP、PCR buffer、rTaq酶。加入本专利技术的引物、待检样本DNA提取物或者样本菌液即可获得PCR反应体系。优选地，所述试剂盒中还可含有阳性对照。所述阳性对照为含有鸡白痢/伤寒沙门菌flhB基因表达的DNA样本。优选地，所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为非鸡白痢/伤寒沙门菌的DNA样本。本专利技术的第二方面，提供了前述快速鉴定鸡白痢/伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：(1)提取样品基因组DNA；(2)加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有前述flhB基因检测引物；(3)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；(4)PCR反应结束后，分析结果。优选地，所述方法为非疾病诊断目的的方法。步骤(1)中，提取样品基因组DNA为现有技术。优选地，步骤(3)中，PCR反应的条件设置为：(a)94℃5min；(b)94℃45s；(c)55℃45s；(d)72℃30s，步骤(b)～(d)循环30次，(e)72℃10min。本专利技术的第三方面，提供了前述试剂盒在制备flhB基因检测产品中的用途。优选地，所述检测产品用于检测和筛选鸡白痢和鸡伤寒沙门菌。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术通过广泛而深入的研究，首次报道鸡白痢和鸡伤寒沙门菌flhB基因与其它血清型沙门菌flhB基因的差异，即鸡白痢和鸡伤寒沙门菌flhB基因的内部缺少197bp的核苷酸序列，以特异性引物通过PCR技术验证了flhB基因在不同血清型沙门菌及其它细菌中的分布及片段大小。本专利技术的试剂盒能快速高通量鉴定鸡白痢和鸡伤寒沙门菌，可作为沙门菌传统血清学分型的辅助方法，并为鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的监测与实验室诊断提供了一种简单快速、重复性好的新方法。附图说明图1：为在NCBI全基因组数据库中Blastn搜索肠炎沙门菌flhB基因；其中，“Description”为含有flhB基因的细菌名称，“Query cover”为搜索到的基因占目标基因全长的覆盖比率，“Ident”为flhB基因核苷酸序列的相似性，红框表示仅有鸡白痢和鸡伤寒沙门菌flhB基因缺少一段核苷酸序列。图2：为鸡白痢和鸡伤寒沙门菌flhB基因与其它血清型沙门菌flhB基因的差异示意图；其中，SP为鸡白痢沙门菌，SG鸡伤寒沙门菌。红色箭头表示flhB引物位置，鸡白痢和鸡伤寒沙门菌扩增的目的条带为182bp，而非鸡白痢和鸡伤寒沙门菌扩增的目的条带为379bp。图3：为PCR鉴定flhB基因在不同血清型沙门菌和其它细菌中的分布和片段大小图片；其中，泳道M为：DL2000Marker；泳道C50041、C50336、SL5928、T3、T9、T8、G2、ZX、Y7、Y8和C500为：flhB基因片段(379bp处有目的条带)，泳道S06004、9855和SG9为：flhB基因片段(182bp处有目的条带)；C50041和C50336为肠炎沙门菌，S06004和6508为鸡白痢沙门菌，SG9为鸡伤寒沙门菌，SL5928为都柏林沙门菌，T3为乌干达沙门菌，T9为火鸡沙门菌，T8为鸭沙门菌，G2为伦敦沙门菌，ZX为罗森沙门菌，Y7为德尔卑沙门菌，Y8为鼠伤寒沙门菌，C500为猪霍乱沙门菌；H37Rv为结核分枝杆菌，11168和110为空肠弯曲菌，S19为布鲁氏菌，EGDe和JS15为李斯特菌，1314和1352为大肠杆菌。图4：为鉴定鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒灵敏度；其中，泳道M为：DL2000Marker；泳道1-8为鸡白痢沙门菌S06004基因组，浓度依次为58.5ng/μl、5.85ng/μl、585pg/μl、58.5pg/μl、5.85pg/μl、585fg/μl、58.5fg/μl、5.85fg/μl。图5：为PCR鉴定鸡场分离的1～24株沙门菌样品中的鸡白痢和鸡伤寒沙门菌，其中，泳道M为：DL2000Marker；泳道1～24为鸡场分离的沙门菌；可扩增出182bp flhB目的条带的泳道为鸡白痢和鸡伤寒沙门菌。具体实施方式在进一步描述本专利技术具体实施方式之前，应理解，本专利技术的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本专利技术实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本专利技术的保护范围。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本专利技术另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速鉴定鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括flhB基因检测引物，所述flhB基因检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。
【技术特征摘要】
1.一种快速鉴定鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括flhB基因检测引物，所述flhB基因检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有无菌水、dNTP、PCR buffer、rTaq酶、样品基因组DNA提取试剂中的一种或多种。3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有阳性对照或阴性对照中的一种或多种。4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为鸡白痢/伤寒沙门菌flhB基因表达的DNA样本。5.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照可为非鸡白痢/伤寒沙门菌的DNA样本。6.如权利要求1～5任一权利要求所述的检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：(1)提取样品基因...
【专利技术属性】
技术研发人员：焦新安，潘志明，熊丹，宋丽，安树敏，耿士忠，焦扬，孙林，陈祥，黄金林，殷月兰，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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