一种鉴别刺槐种质资源亲缘关系的SSR标记引物组及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种鉴别刺槐种质资源亲缘关系的SSR标记引物组及其应用。一种鉴别刺槐种质资源亲缘关系的SSR标记引物组，SSR标记引物组共四组，每组包括4对引物；本发明专利技术还涉及利用上述引物组鉴别刺槐种质资源亲缘关系的方法。本发明专利技术首次采用SSR标记引物组鉴别刺槐种质资源亲缘关系，通过筛选16个SSR标记并设计特异引物，从而确保了鉴定的准确性，较现有鉴别方法可以显著缩短鉴别时间。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴别刺槐种质资源亲缘关系的SSR标记引物组及其应用
本专利技术涉及一种鉴别刺槐种质资源亲缘关系的SSR标记引物组及其应用，属于生物技术

技术介绍
SSR简称重复序列标记(Simplesequencerepeats，SSR)，是基于PCR(基因扩增)技术的分子标记，具有高多态性、重复性、共显性、丰富性等优点，对于分析品种亲缘关系和遗传多样性研究具有重要意义，通过确定遗传距离，来分析其亲缘关系，遗传距离为零时，表明植株出自同一无性系。中国专利文献CN102286613A(申请号201110127982.7)公开了防天麻退化的选育方法，它是采用AFLP或ISSR和SSR及天麻素含量标记同时检测天麻，经软件绘制聚类图并绘制天麻遗传多态性与天麻素含量关系图，从而快速分析天麻种质资源亲缘关系，鉴别天麻自交与杂交体，快速选择确定天麻亲本，快速鉴定天麻杂种纯度等，能使中药天麻优质可持续发展的育种选择方法。目前，现有技术多采用挖根的方法来调查刺槐是否出于同一无性系，然而由于刺槐连续多代萌生林无性系小株之间的连接根系可能已经死亡，挖根的方法并不能准确判断它们的萌蘖扩散范围和扩散规律。而且挖根的方法耗时费力，在判断刺槐的萌生植株是否来自于同一个基株时存在一定的主观性。如何准确鉴别刺槐的萌生植株是否来自于同一个基株成为研究刺槐扩散格局与过程的关键问题，也是判断是否是同一无性系的主要环节。但由于目前未有采用SSR标记鉴别刺槐种质资源亲缘关系的相关报道，如何利用相关SSR标记进行检测，从而提高检测的准确性和可靠性成为解决上述问题的关键。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种鉴别刺槐种质资源亲缘关系的SSR标记引物组及其应用。本专利技术技术方案如下：一种鉴别刺槐种质资源亲缘关系的SSR标记引物组，SSR标记引物组共四组，每组包括4对引物；第一组的四对SSR标记引物分别为，标记Rops04的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；标记RP106的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；标记Rops09的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；标记RP150的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；第二组的四对SSR标记引物分别为，标记RP035的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；标记RP109的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.11所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；标记RP200的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.13所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.14所示；标记RP032的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.15所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.16所示；第三组的四对SSR标记引物分别为，标记Rops02的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.17所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.18所示；标记Rops06的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.19所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.20所示；标记Rops08的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.21所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.22所示；标记RP206的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.23所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.24所示；第四组的四对SSR标记引物分别为，标记Rops05的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.25所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.26所示；标记Rops10的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.27所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.28所示；标记RP165的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.29所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.30所示；标记RP01B的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.31所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.32所示。根据本专利技术优选的，所述标记Rops04的上游引物、标记RP150的上游引物、标记RP200的上游引物、标记RP032的上游引物、标记Rops06的上游引物、标记RP206的上游引物、标记Rops05的上游引物、标记Rops10的上游引物的5’端连接有荧光标签FAM；所述标记RP106的上游引物、标记RP109的上游引物、标记Rops08的上游引物、标记RP01B的上游引物的上游引物的5’端连接有荧光标签HEX；所述标记Rops09的上游引物、标记RP035的上游引物、标记Rops02的上游引物、标记RP165的上游引物的5’端连接有荧光标签TAM。一种利用上述SSR标记引物组鉴别刺槐种质资源亲缘关系的方法，包括如下步骤：(1)取待鉴别样品，提取总DNA；(2)以步骤(1)制得的总DNA为模板，分别用上述鉴别刺槐种质资源亲缘关系的四组SSR标记引物进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；(3)对步骤(2)制得的PCR扩增产物进行分析，当扩增出SSR标记时，用1表示，当未扩增出SSR标记时，用0表示，将每对SSR标记扩增后的结果转换为矩阵，用非加权算术平均聚类方法(UPGMA)分析计算遗传距离，得出刺槐种质资源亲缘关系。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，样品为叶片或枝条。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，总DNA的提取方法采用改良的CTAB法。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增体系如下，总体积为10μL：4μLTakaraMulti-plexPCRMasterMix，浓度为10μM的4条上游引物每条各0.2μL，浓度为10μM的4条下游引物每条各0.2μL，10～30ng/μL模板1μL，加3.4μLddH2O补足至反应总体积；根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增程序如下：94℃预变性15min；94℃变性30s，55℃退火90s，72℃延伸60s，共28个循环；60℃终延伸30min，4℃终止反应。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中的分析为：将步骤(2)的PCR扩增产物经电泳后进行测序；然后用软件GeneMarkerver.2.4.0统计每个个体16对SSR标记所有等位基因的长度，并与标准进行对照，当长度在标准范围内时，为有效扩增出SSR标记，当长度在标准范围外时，为未扩增出SSR标记；所述的标准范围如下：标记Rops04的标准范围为105～110bp；标记RP106的标准范围为143～154bp；标记Rops09的标准范围为89～150bp；标记RP150的标准范围为199～217bp；标记RP035的标准范围为89～112bp；标记RP109的标准范围为136～160bp；标记RP200的标准范围为160～198bp；标记RP032的标准范围为109～135bp；标记Rops02的标准范围为107～138bp；标记Rops06的标准范围为117～144bp；标记Rops08的标准范围为191～205bp；标记RP206的标准范围为222～246bp；标记Rops05的标准范围为120～138bp；标记Rops10的标准范围本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴别刺槐种质资源亲缘关系的SSR标记引物组，SSR标记引物组共四组，每组包括4对引物；第一组的四对SSR标记引物分别为，标记Rops04的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；标记RP106的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；标记Rops09的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；标记RP150的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；第二组的四对SSR标记引物分别为，标记RP035的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；标记RP109的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；标记RP200的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；标记RP032的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；第三组的四对SSR标记引物分别为，标记Rops02的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；标记Rops06的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；标记Rops08的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；标记RP206的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；第四组的四对SSR标记引物分别为，标记Rops05的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示；标记Rops10的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示；标记RP165的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；标记RP01B的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示。...

【技术特征摘要】
1.一种鉴别刺槐种质资源亲缘关系的SSR标记引物组，SSR标记引物组共四组，每组包括4对引物；第一组的四对SSR标记引物分别为，标记Rops04的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；标记RP106的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；标记Rops09的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；标记RP150的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；第二组的四对SSR标记引物分别为，标记RP035的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；标记RP109的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.11所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；标记RP200的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.13所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.14所示；标记RP032的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.15所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.16所示；第三组的四对SSR标记引物分别为，标记Rops02的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.17所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.18所示；标记Rops06的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.19所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.20所示；标记Rops08的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.21所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.22所示；标记RP206的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.23所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.24所示；第四组的四对SSR标记引物分别为，标记Rops05的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.25所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.26所示；标记Rops10的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.27所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.28所示；标记RP165的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.29所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.30所示；标记RP01B的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.31所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.32所示。2.如权利要求1所述的SSR标记引物组，其特征在于，所述标记Rops04的上游引物、标记RP150的上游引物、标记RP200的上游引物、标记RP032的上游引物、标记Rops06的上游引物、标记RP206的上游引物、标记Rops05的上游引物、标记Rops10的上游引物的5’端连接有荧光标签FAM；所述标记RP106的上游引物、标记RP109的上游引物、标记Rops08的上游引物、标记RP01B的上游引物的上游引物的5’端连接有荧光标签HEX；所述标记Rops09的上游引物、标记RP035的上游引物、标记Rops02的上游引物、标记RP165的上游引...

【专利技术属性】
技术研发人员：李传荣，王灿灿，王年，申卫星，郭慧玲，张兴忠，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37