一种干旱诱导的花粉特异性启动子及其应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学、基因工程技术领域，具体涉及一种水稻花粉特异性启动子及其应用。本发明专利技术是水稻OsCLO7基因的启动子序列如SEQIDNO.1所示。该启动子活性受花药发育过程及干旱胁迫影响。定量PCR检测结果显示：OsCLO7主要在水稻穗中表达，更明确地是在穗组织的雄蕊中表达；随着发育过程推进表达增强；幼穗发育前期受干旱胁迫诱导表达。该启动子驱动的GUS报告基因在水稻减数分裂后不同发育时期的花药中表达，更明确地是在花药的花粉粒中表达；穗发育前期GUS活性受干旱诱导，且仅限于花粉粒。本发明专利技术中的启动子可被用于构建驱动外源基因在花粉粒中特异性表达的转基因载体，在农业生产上均具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学和基因工程
，具体涉及一种干旱诱导的花粉特异性启动子及其应用。
技术介绍
启动子是基因的一个组成部分，通常位于5，端起始密码子上游区域。该区域含有转录调控因子、RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。启动子(Promoters)就像“开关”，决定基因的活动。植物基因的启动子按其基因的表达方式分为组成型启动子(constitutivepromoter)、诱导型启动子(induciblepromoter)和组织特异型启动子(tissue-specificpromoter)。组成型启动子是指能在植物所有或大部分组织中高效启动外源基因表达的启动子，而组织特异性启动子所驱动的基因只在植物生长的某个或某些过程中的特定的器官或组织中表达。例如，叶片特异性启动子、雄蕊特异性启动子等等。发掘这些启动子，对其活性进行鉴定，不仅有助于阐明基因在植物生长发育中的作用，而且可以借助这些启动子，驱动目的基因在特定组织中的有效表达，从而应用于科学研究和农业生产实践。诱导型启动子，是指在某些特定条件例如物理、化学、生物信号存在时，启动子可以驱动下游的基因增强表达，转录水平大大提高。植物由于长期暴露在大自然环境中，时刻受到来自环境胁迫的影响，相应地在进化过程中产生大量基因的表达受环境胁迫因子，比如高温、干旱、病虫害的诱导，调控体内信号通路和分子活动，抵御逆境。随着温室效应加剧、工农业用水剧增，干旱已成为威胁农业生产的主要因素。作物生殖生长阶段特别是雄蕊的发育最容易受环境胁迫的影响，造成的减产也最为严重。因此，发掘雄蕊发育特异的干旱胁迫响应基因，应用其启动子驱动目的基因的表达，对于研究植物生殖抗旱及植物遗传工程都有重要意义。本专利技术中涉及的OsCLO7基因是水稻油体钙蛋白(caleosins,CLOs)基因家族8个成员中的一员，该基因随幼穗发育进程在花粉粒中表达上升，同时受干旱胁迫诱导。本专利技术提供了OsCLO7基因启动子的驱动活性，该启动子可以驱动基因在水稻花粉粒中特异性表达，在干旱胁迫下活性增强，可以预见，它在科研或者生产实践上均具有较强应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种组织特异型启动子及其应用，尤其提供一种受干旱胁迫诱导的诱导型启动子及其应用。本专利技术包括启动子序列的克隆、植物转基因载体的构建、该启动子在不同组织中驱动基因表达的活性分析，以及该启动子对干旱胁迫的响应分析。该启动子属于一种组织特异性启动子，且响应干旱胁迫，因此在水稻生殖抗旱研究领域及植物转基因
具有重要价值。本专利技术提供的启动子，是从水稻的OsCLO7基因(Os06g0254600)起始密码子上游克隆到的一段约2224bp大小的DNA序列，其核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。本专利技术还包括，利用所述启动子（SEQIDNO.1顺序）构建的基因工程载体；本专利技术还包括，利用所述启动子（SEQIDNO.1顺序）作为花粉粒特异型启动子在基因工程中的应用，该启动子能够驱动目的基因在雄蕊发育9-12期的花粉中特异性表达。本专利技术还包括，利用所述启动子（SEQIDNO.1顺序）作为雄蕊发育早期花药中干旱诱导型启动子的应用，该启动子能在干旱胁迫下驱动目的基因表达于发育中的花粉粒中。本专利技术中的启动子可被用于构建驱动外源基因在花粉粒中特异性表达的转基因载体，在科研和农业生产上均具有重要的应用价值。该启动子的获得，是来源于对OsCLO7基因的表达特征的研究及该基因的抗旱性研究。首先，从水稻幼穗发育过程的干旱胁迫响应芯片数据中获得该基因的表达特征，OsCLO7是水稻8个油体钙蛋白中唯一既受发育调控表达又受干旱胁迫诱导表达的基因(参见图1)；应用定量PCR检测该基因的表达，分析各组织的表达谱，发现其只在雄蕊中特异性表达(参见图2)。比较各组织干旱后的OsCLO7表达情况，发现其在幼穗发育早期，特别是减数分裂时期受干旱诱导表达，减数分裂以后本底表达已很高，不再受干旱胁迫诱导(参见图3)。将该启动子构建在含有报告基因GUS(β-glucuronidase，编码葡萄糖醛酸酶)的载体中(参见图4)，通过农杆菌介导的水稻转基因技术获得转基因阳性株。取水稻各组织检测GUS活性，发现它所驱动的GUS报告基因只在水稻穗发育后期的花药中高表达，更特异地是在花粉粒中表达(参见图5)。因此，OsCLO7基因启动子可以驱动外源基因在特定的组织中表达，从而达到定向地转基因的目的。将转基因植物进行各个时期的干旱处理，检测GUS活性，结果和预期一致，只在花药中有活性，而且干旱后的花药中显示了更强的表达。穗发育早期对照材料中几乎检测不到花药的GUS活性，而在干旱的对应时期材料中花药GUS活性较强，花粉粒成熟期对照和处理的花药都有很强的GUS活性(参见图6)。附图说明图1芯片数据分析水稻油体钙蛋白基因在幼穗中干旱胁迫下的表达。水稻油体钙蛋白基因家族共有8个成员，OsCLO1到OsCLO7。2~3mm，3~4mm，4~5mm，5~7mm为颖花的长度。C为对照，D为干旱处理。OsCLO7是CLO家族中唯一的干旱胁迫后在各时期花中表达明显上调的基因。图2OsCLO7的组织表达表达谱。图3OsCLO7的干旱响应表达谱。图4OsCLO7基因启动子的载体构建示意图。图5水稻各组织GUS活性分析。其中，a为一周的水稻苗(bar=1cm)；b-d分别为成熟期的根茎叶(bar=1mm)；e,f,g,h,i分别为第6(bar=0.5mm)、8、10、12、14期的颖花(bar=2mm)；j,k,l分别为12期的雌蕊、花药和花粉粒(bar=0.1mm)；m为授粉4天的幼胚(bar=1mm)。GUS活性主要出现于晚期花粉粒中。图6穗发育时期进行干旱处理后花药的GUS活性比较(bar=0.1mm)。干旱胁迫后GUS信号在花粉粒发育的早期就会出现，且信号强度有所升高。具体实施方式下面结合具体实施例进一步阐明本专利技术。应理解这些实施例仅用于说明本专利技术而不限制本专利技术的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法通常按照常规条件，即Sambrook等著的《分子克隆》实验手册中所叙述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1水稻种植和干旱处理以水稻日本晴为材料，种植于人工控制的温室和室外自然环境的盆中。干旱处理在温室进行。干旱处理方式：水稻在正常条件下生长至生殖发育期，然后在生殖发育期停止浇水，待土壤相对含水量降至15-20%后，保持一周，取样用于基因的表达分析、GUS染色。实施例2基因芯片分析干旱条件下水稻幼穗发育过程基因的表达水稻日本晴种子催芽后，移栽到温室塑料盆的土中生长，50天后密切观察并检查水稻的生长状态，在从营养期刚刚转入生殖生长时进行干旱处理：倒去盆中多余水分，停止浇水，待土壤水分降低到30%左右时，每天补充少量水维持该水分含量一个礼拜，取不同大小(2~3mm，3~4mm，4~5mm，5~7mm)的水稻花，分别收集并编号，以正常生长条件下本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种干旱诱导的花粉特异性启动子，其特征在于是从水稻的OsCLO7基因起始密码子上游克隆到的约2224bp大小的DNA序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种干旱诱导的花粉特异性启动子，其特征在于是从水稻的OsCLO7基因起始密码子上游克隆到的约2224bp大小的DNA序列，其核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。
2.一种利用权利要求1所述的启动子构建的基因工程载体。
3.如权利要求1所述的启动子...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛晓春，马红，黄蔚，姚玲娅，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31