HER2/neu组织特异启动子变异体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及一种经过优化的HER2/neu组织特异启动子变异体及其用途。首次揭示一种经过点突变的HER2/neu组织特异性启动子，该启动子选择性地在HER2/neu阳性细胞中具有启动子活性；并且其在低氧条件下具有强的启动子活性，因此可被应用于抗HER2阳性肿瘤基因治疗领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物学和医学领域，更具体地，本专利技术涉及一种经过优化的HER2/neu组织特异启动子变异体及其用途，该启动子变异体可在Her2/neu阳性细胞中驱动其下游目的基因表达，尤其可驱动目的基因在低氧环境下获得更高效的表达。
技术介绍
erbb2基因编码产物是表皮生长因子受体2(epidermalgrowth-factorreceptor2)，又称HER2/neu抗原，其胞内段具有蛋白酪氨酸激酶活性。HER2/neu与配体结合后可以活化下游的多个信号途径，包括：Ras/MAPK和PI3K/AKT，最终激活c-fos和c-jun等转录因子，促进有丝分裂，引起细胞的增殖。HER2/neu是一种肿瘤相关抗原，过度表达在多种人类肿瘤组织并与这些肿瘤的发生发展密切相关，包括乳腺癌、卵巢癌、胃肠道肿瘤、肺腺癌等。因此靶向HER2/neu阳性肿瘤是肿瘤生物治疗的热点。最显著的是，HER2基因是影响乳腺癌预后的一个重要因素，大约有25％-30％左右的乳癌患者，受到体内癌细胞HER-2基因过量表现的影响，他们的癌细胞不仅繁殖能力强，对部份化学治疗药物也容易有抗药性，造成病患即使接受手术治疗，癌细胞仍然有较高复发及转移的机率，无法长期存活。乳腺癌病人可分为Her-2/neu阳性或Her-2/neu阴性两种截然不同的预后之乳癌。HER-2蛋白过量表达的肿瘤生长速度较快且生物行为较为恶性，使得手术后复发率高于其他类型的乳癌。因此，以HER2/neu抗原为靶标的免疫治疗方案是治疗Her2阳性乳腺癌的研究热点，包括单克隆抗体、HER2/neu重组疫苗、HER2/neu-热休克融合蛋白、HER2/neu致敏的树突状细胞疫苗等，其中抗HER2/neu单抗(英文名：Herceptin；赫赛汀，注射用曲妥珠单抗)已广泛应用于临床治疗HER2过度表达的转移性乳腺癌和转移性胃癌，但抗体治疗的成本无疑是昂贵的，并且对一些正常组织具有一定的毒性。因此，开发靶向HER2/neu、毒性低、成本低廉、制备方便、高效的生物新药领域的重要课题。抑癌基因(tumorsuppressorgene)也称为肿瘤抑制基因。抑癌基因的产物能够在多个环节上保护正常细胞，使其免于最终发生癌变，主要参与抑制细胞增殖、促进细胞分化、诱导肿瘤细胞凋亡和抑制细胞迁移，因此在肿瘤发生发展过程中起负调控作用。抑癌基因的产物主要包括转录调节因子(如，Rb、p53)、负调控转录因子(WT)、周期蛋白依赖性激酶抑制因子(如，p15、p16、p21)、DNA修复因子(如BRCA1、BRCA2)、与发育和干细胞增殖相关的信号途径组分(如，APC、Axin)、信号通路的抑制因子(如rasGTP酶活化蛋白，NF-1)，磷脂酶(phosphataseandtensionhomologydeletedonchromosometengene，PTEN))等。肿瘤抑制蛋白Axin是一种多结构域支架蛋白，对Wnt/β-catenin、JNK信号途径具有负向调控作用，还能够活化另一个抑癌基因p53，因此参与细胞生长、增殖、分化、癌变和凋亡等多种重要细胞命运的调控过程。在许多肿瘤组织中都发现了Axin异常表达和功能缺失，如肺癌、大肠癌、乳腺癌，恶性黑素瘤等，因此Axin功能异常参与多种肿瘤发生、发展的机制涉及信号转导、细胞周期、细胞增殖、凋亡以及细胞黏附等多个方面。PTEN是具有双特异性磷酸酶活性的肿瘤抑制蛋白，其编码基因在多种恶性肿瘤中发生突变或缺失，导致其抑癌功能减弱或丧失，在肿瘤的发生、发展中起重要作用。目前发现卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、恶性胶质瘤等存在PTEN基因的突变、缺失或低表达，从而影响其肿瘤抑制功能。PTEN主要通过抑制PI3k/Akt/mTor信号转导通路，负向调控细胞的增殖、侵袭、转移、血管形成和多药耐药等恶性生物学特征。因此，利用携带促进野生型抑癌基因如Axin、PTEN靶向肿瘤组织可以诱导肿瘤细胞的凋亡、抑制肿瘤细胞的过度增殖、促进肿瘤细胞分化、增加传统化疗药物对相关肿瘤的化疗效果，逆转肿瘤细胞的多药耐药等，目前已经成功应用于部分肿瘤的临床研究，并取得了初步成果。然而，如何将上述抑癌基因选择性的靶向肿瘤组织、减少对正常组织的毒性，并在肿瘤组织中获得优势表达，是肿瘤基因治疗领域的一个迫切需要解决的技术难题。解决肿瘤靶向方面的一条途径是，通过将控制肿瘤相关抗原表达的启动子或调控元件构建于抗肿瘤基因的上游，使目的基因选择性高表达在表达该肿瘤相关抗原的肿瘤细胞中，实现目的基因对肿瘤的抑制作用，这一方案无疑拥有潜在的临床应用前景。此外，研究调控肿瘤相关抗原表达的启动子以及调控序列也对研究肿瘤发生发展的机制具有指导意义。HER2/neu是乳腺癌等肿瘤组织特异表达的肿瘤相关抗原，相关文献(MarionLanteri等，BreastCancerResearch2005，7:R487-R494)曾报道过控制HER2/neu的启动子基因，能够将具有细胞毒效应的基因选择性的靶向HER/neu阳性的肿瘤细胞。肿瘤组织微环境已被公认是促进肿瘤进展的重要因素，其中低氧是肿瘤微环境中的一个关键病理因素。低氧在肿瘤生物学中的许多方面扮演着重要的角色，包括肿瘤组织的血管生成、上皮间质转化、侵袭、转移、遗传不稳定性、永生化和干细胞维持、免疫逃避、代谢、PH调节和放射治疗耐受等。肿瘤内低氧是常见的并且往往是最严重的，正常乳腺组织的氧分压是65mmHg，而乳腺癌瘤内氧分压是10mmHg，会增加患者死亡风险，这一风险独立于肿瘤大小，分期，组织学分型，等级，或淋巴结状态等因素。低氧促进肿瘤进程的机制在于，作为转录因子的低氧诱导因子(hypoxia-induciblefactor，HIF)促进肿瘤组织中的血管生成、诱导免疫抑制因子基因(如IDO，TGF-β，IL-10等)和癌基因(如，HER/neu，BCR-ABL，EGFR)但失活抑癌基因(如P53，PTEN等)的表达等。因此将低氧因素考虑到启动子设计方案中，使目的基因在具有低氧特征肿瘤组织中获得优势表达，是提高肿瘤靶向治疗效果的一个有效手段。因此针对HER2/neu阳性肿瘤细胞，改造控制HER2/neu抗原表达的启动子序列，使下游目的基因能够在肿瘤低氧微环境下并选择性的在HER2/neu阳性肿瘤细胞中获得优势表达，是本专利技术的目标。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种经过优化的HE本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸选自下组：(1)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸；(2)核苷酸序列在严格条件下能够与SEQ ID NO:1杂交且具有指导目的基因在HER2/neu阳性细胞或组织中特异性表达功能的多核苷酸；(3)核苷酸序列与(1)‑(2)任一限定的序列互补的多核苷酸。

【技术特征摘要】
1.一种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸选自下组：
(1)核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的多核苷酸；
(2)核苷酸序列在严格条件下能够与SEQIDNO:1杂交且具有指导目的
基因在HER2/neu阳性细胞或组织中特异性表达功能的多核苷酸；
(3)核苷酸序列与(1)-(2)任一限定的序列互补的多核苷酸。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，(2)或(3)所述的多核苷酸
中，对应于SEQIDNO:1的第156位位置的核苷酸为C。
3.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求1或2所述的核酸，
作为启动子元件。
4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述的载体还含有与所述的
核酸可操作地连接的目的基因。
5.如权利要求4所述的载体，其特征在于，所述的目的基因选自：能够
被转录成多肽的RNA分子的目的基因，被转录成反义RNA分子或被转录成
针对内源基因的干扰RNA或miRNA的目的基因；较佳地，所述的多肽是对
于防止疾病有效的多肽，或是能指示...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘书逊，曹雪涛，马玲，江金霞，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海;31