本发明专利技术通过扩增圆红冬孢酵半乳糖激酶基因组DNA上下游序列，进行生物学信息分析和功能验证，获得可广泛用于红酵母中红冬孢酵母属(Rhodosoporidium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)和红酵母属(Rhodotorula)中基因表达、遗传工程操作和菌株改良的启动子和终止子，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。本发明专利技术还涉及含有这些元件的DNA表达盒或重组载体，及利用相关元件构建红冬孢酵母属、锁掷酵母属和红酵母属基因工程菌株的方法及相应的菌株。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)的启动子终止子及其用途，包括基因工程菌株构建所必需的转化方法等。
技术介绍
微生物是自然界中分布最广泛的物种之一，具有卓越的生物合成能力，几乎能合成地球上所有的有机化学品。与多细胞生物相比，微生物的代谢途径虽然相对简单，但其化合物的生产高效、快捷，具有反应条件温和、可控性强、易于大规模生产等特点，可作为一个优良的细胞工厂。自然界中一部分微生物在特定条件下(如氮源缺乏)能在胞内贮存超过其细胞干重20％的油脂，其中以甘油三酯为主，具有这种表型的微生物称为产油微生物，包括细菌、酵母、霉菌、藻类等(Ratledge,C.andWynn,J.P.AdvApplMicrobiol,2002,51,1-51.)。利用微生物转化生物质资源生产油脂，可发展成基本不依赖耕地、可连续生产、降低农业污染、资源综合利用的新技术，是形成化学品的石化资源替代品新的生产途径(赵宗保.中国生物工程杂志,2005,25,8-11.)。做为某一化学品的天然生产菌株或环境治理应用菌株，其特定的生产性能往往并非最优化。如何优化或改变工业菌株的代谢网络和表达调控网络，以提高生物基产品的积累速度或定向控制靶产品的质量，是当今生物
基因工程改造的热点和难点。虽然对于一些常规酵母的基因工程改造已经较为成熟(AlperH,StephanopoulosG.NatRevMicrobiol,2009,7,715-723.)，但是对于这些非常规产油酵母的遗传操作尚处于起步阶段，许多非常规产油酵母没有合适的基因操作平台。开发合适的基因操作方法，对于这些非常规微生物的应用意义重大。圆红冬孢酵母属于担子菌门异宗配合型真菌，是发酵工业中一种极为重要的微生物，可利用源于生物质的己糖和戊糖为原料生产重要的生物基产品：微生物油脂，胞内油脂可达细胞干重的60％以上(RatledgeC,WynnJP.Adv.Appl.Microbiol.2002,51:1-51；LiY,ZhaoZ,BaiF.EnzymeMicrob.Technol.2007,41(3):312-317)；工业用酶或药物合成用酶如磷酸二酯酶、苯丙氨酸解氨酶(HodginsDS.JBiol.Chem.1971,246(9):2977-2985；GilbertHJ,ClarkeIN,GibsonRK,etal.JBacteriol.1985,161(1):314-320)、D氨基酸氧化酶(GaddaG,NegriA,PiloneMS.JBiol.Chem.1994,269(27):17809-17814；LiaoGJ,LeeYJ,LeeYH,etal.Biotechnol.Appl.Biochem.1998,27(Pt1):55-61)等以及β-胡萝卜素和胞外多糖；并在污水处理和生物制药中有较广泛的应用。实验结果表明，该菌可同时利用五碳糖和六碳糖为底物，抗逆性好，能直接以玉米秸秆酸水解液为碳源积累油脂，可实现生物质到生物基产品的高效转化(李永红,刘波,孙艳,等.中国生物工程杂志,2005,25(12):39-44)。目前R.toruloides功能基因的研究主要通过基因克隆、异源表达和酿酒酵母功能互补分析来进行(GilbertHJ,ClarkeIN,GibsonRK,etal.JBacteriol.1985,161(1):314-320；LiaoGJ,LeeYJ,LeeYH,etal.Biotechnol.Appl.Biochem.1998,27(Pt1):55-61)。但要从分子水平上进行R.toruloides油脂积累机制、遗传发育、生长代谢和菌株遗传改造研究，必须具备相应的遗传操作系统。然而对于广泛分布、工业应用前景良好的R.toruloides而言，由于其特殊分类地位和生化特性以及遗传操作系统的缺乏，使得其遗传改良和分子机制研究进展缓慢，目前有效的遗传操作系统是基于其自身3-磷酸甘油酸激酶启动子pPGK和甘油醛-3-磷酸脱氢酶GPD启动子的农杆菌介导转化体系(LinXP,WangYN,ZhangSF,etal.FemsYeastRes.2014,14:547–555)。但使用的组成型启动子无法选择性调控某一基因转录，不适合细胞毒性基因的过表达；同时，代谢工程也需要更多的启动子和终止子元件可供选择，以实现某一代谢途径各基因表达水平的精确调控。诱导型启动子在特定的物理或化学信号的刺激下，调控下游基因转录的启动和关闭，对一些细胞毒性基因的遗传操作尤为重要。半乳糖激酶Gal1，其转录受葡萄糖的严格抑制和半乳糖、棉籽糖等的诱导激活。非常适用于目的基因的精确表达调控。虽然曾有众多研究者分离酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或其它子囊酵母的半乳糖激酶启动子、或其它半乳糖诱导启动子用于自身的基因工程操作(刘巍峰,高东,王祖农.菌物系统,1998,17(3),256-261.；CN201410143885.0；CN201180008591.1；SchultzLD,HofmannKJ,MylinLM,etal.Gene.1987,61(2):123-133.；ChoiES1,SohnJH,RheeSK.ApplMicrobiolBiotechnol.1994,42(4):587-594.；LiJ,WangS,VanDusenWJ,etal.BiotechnolBioeng.2000,70(2):187-196.)，但未见该类启动子用于红冬孢酵母属(Rhodosoporidium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)和红酵母属(Rhodotorula)中基因表达、遗传工程操作和菌株改良的基因工程操作的报道。同时，本领域技术人员周知“不同的微生物在遗传背景、基因表达模式、生理生化特征方面存在大的差异，即使同为酵母，不同的种属间也存在很大的差异，例如，同属子囊菌门的酿酒酵母、毕赤酵母、耶氏解脂酵母，必须分别构建其遗传体系，选择自身来源启动子”。然而，启动子对于遗传操作系统来说必不可少。因此，分离能够在这些红酵母中启动报告基因表达的半乳糖激酶启动子成为目前研究的焦点。终止子序列，是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列，同时也决定mRNA的稳定性、转录效率和mRNA从转录复合体的释放。商业化酵母表达载体和报道的合成生物学文献中，多选择高表达基因的终止子做为转录终止元件。
技术实现思路
鉴于上述现有技术瓶颈，本专利技术的主要目的是提供可通用于红冬孢酵母属(Rhodosoporidium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)和红酵母属(Rhodotorula)中基因表达、遗传工程操作和菌株改良的中外源基因表达的启动子和终止子，及采用合适的转化技术对这些红酵母菌株进行改良的方法。为实现本专利技术的目的，本专利技术通过对圆红冬孢酵母的基因组序列进行分析，获得响应半乳糖诱导的半乳糖激酶启动子(GAL1p)序列，并进一步通过PCR技术从圆红冬孢酵母染色体DNA中成功分离了包含有效启动子的DNA片段，采用本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种半乳糖激酶启动子，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.一种半乳糖激酶启动子，其特征在于：核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.一种含有权利要求1所述的半乳糖激酶启动子的核苷酸序列的DNA表达盒。3.按照权利要求2所述的DNA表达盒，其特征在于：还含有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列作为终止子，其中SEQIDNO：1所示的序列位于SEQIDNO：2所示的序列的上游，SEQIDNO：1和SEQIDNO：2间为编码目的基因的开放阅读框架。4.按照权利要求3所述的DNA表达盒，其特征在于：所述编码目的基因的开放阅读框架的cDNA序列具有如SEQIDNO：4所示的核苷酸序列。5.一种包含权利要求2-4中任一项所述的DNA表达盒的重组载体。6.按照权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述载体为游离型或者整合型载体。7.按照权利要求6所述的重组载体，其特征在于：中所述整合型载体为农杆菌介导的双元表达载体，或者为携带有靶基因翼侧1500-4000碱基同源重组臂的同源重组载体；所述同源重组载体骨架或所述游离型载体选自大肠杆菌克隆载体或酵母穿梭载体，优选PZPK、pZ...
【专利技术属性】
技术研发人员：张素芳，赵宗保，马斯佳，王雅南，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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