一种miRNA模拟物及几丁质合成抑制类生物农药及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种miRNA模拟物，以及几丁质合成抑制类生物农药，所述miRNA模拟物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术的miRNA模拟物及几丁质合成抑制类生物农药具有低剂量高效率的优点，杀虫效果显著。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于昆虫控制领域，具体涉及一种miRNA模拟物及几丁质合成抑制类生物农药，以及该生物农药的应用。
技术介绍
几丁质是N-乙酰氨基葡萄糖的多聚糖，广泛存在于真菌和节肢动物中，是昆虫外骨骼、气管与中肠围食膜(peritrophicmatrix，PM)的重要组分(Cohen,2001；Merzendorfer,2006)。昆虫几丁质的生物合成通路以海藻糖为起点，经过8个酶的参与形成几丁质(Candy等，1962)。目前研究最多的是海藻糖酶(Trehalase,Tre)和几丁质合成酶(Chitinsynthase，CHS)，即几丁质合成的第一个和最后一个酶(Zhu等，2016)。昆虫通常存在2个几丁质合成酶基因，分别为几丁质合成酶A基因(chitinsynthetaseA，CHSA)和几丁质合成酶B基因(chitinsynthetaseB，CHSB)(Zhu等，2016)。几丁质合成酶A基因主要在表皮和气管中表达，负责表皮和气管几丁质的合成；而几丁质合成酶B基因仅在中肠中表达，负责中肠围食膜几丁质的合成(Arakane等，2004；Merzendorfer和Zimoch，2003；Qu和Yang，2011)。在半翅目昆虫中，如褐飞虱(Nilaparvatalugens)、灰飞虱(Laodelphaxstriatellus)、长红猎蝽(Rhodniusprolixus)仅克隆得到几丁质合成酶A(Mansur等，2014；Wang等，2012b)。因此几丁质合成酶A对于半翅目昆虫的生长发育和繁殖有着不可或缺的作用。通过基因沉默技术抑制昆虫几丁质合成相关基因的表达，有望对害虫几丁质合成进行调控，进而控制其危害。RNAi技术指通过导入dsRNA或者siRNA，使得内源的靶标mRNA被切割降解，在细胞、组织或者活体中实现转录后水平基因沉默的手段(Flores-Jasso等，2004；Sharp，1999；Valdes等，2003)。通过RNAi干涉几丁质合成酶A的研究已经在冈比亚蚊(Anophelesgambiae)、亚洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)、褐飞虱等9种昆虫中有所报道。完全变态昆虫中，通过RNAi沉默CHSA，会导致幼虫-幼虫、幼虫-蛹和蛹-成虫的转变障碍；半变态昆虫中，沉默几丁质合成酶A会导致若虫-若虫和若虫-成虫的蜕皮障碍，不仅显著降低虫体的几丁质含量，也会导致其死亡率显著升高(Chen等，2008；Wang等，2012b)。除了外源dsRNA介导的RNAi之外，microRNA(miRNA)介导的基因沉默也有作为生物农药的潜力。miRNA是一类生物内源的单链非编码小RNA(non-codingsmallRNA)，长度大约为21-24nt。在动植物中，miRNA在转录后水平对基因表达起到关键调控作用，其主要的作用方式是与靶基因mRNA靶标区域的配对，引导沉默复合体(RISC)降解靶标mRNA或阻止其翻译(Carrington和Ambros，2003；Smibert和Lai，2008)。miRNA参与了动植物的生理活动，在细胞分化、凋亡、增殖，生长发育调节和免疫应答等方面均具有重要功能(Carrington和Ambros，2003)。由于CHSA在昆虫生长发育中的重要性和几丁质存在的特殊性，以几丁质合成酶为靶标的农药非常适合应用到害虫控制中。此类化学农药不仅有核苷肽类化合物，如尼克霉素(nikkomycins)类化合物，还有苯甲酰基脲类化合物(benzoylphenylurea，BPU)，如已成功商品化的Diflubenzuron(DFB)和Lufenuron(LFN)(Gangishetti等，2009)。这些杀虫剂的重要优点是对环境安全友好。但由于昆虫抗药性的增加，以及新型结构研发难度大，这极大的限制了此类杀虫剂的使用。目前的褐飞虱防治方法包括农业防治、化学防治和生物防治等。农业防治方法效率低下，防治效果差，而化学药物往往导致昆虫的抗性作用以及环境污染等问题，使得褐飞虱防治工作难以得到持续性发展。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点和不足，提供一种能够有效防治昆虫(特别是褐飞虱)的几丁质合成抑制类生物农药。本专利技术的另一个目的是提供所述几丁质合成抑制类生物农药在制备用于防治昆虫的药物中的应用。本专利技术的又一个目的是提供含有所述几丁质合成抑制类杀虫剂的组合物。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种miRNA模拟物，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。优选地，合成所述miRNA模拟物的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，合成所述miRNA模拟物的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。本专利技术还提供了一种几丁质合成抑制类生物农药，包括作为活性成分的miRNA模拟物，所述miRNA模拟物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。优选地，合成所述miRNA模拟物的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。本专利技术还提供了所述miRNA模拟物或所述几丁质合成抑制类生物农药在制备用于防治昆虫的药物中的应用。优选地，所述昆虫为褐飞虱。本专利技术还提供了含有所述miRNA模拟物或所述几丁质合成抑制类生物农药的组合物。特别地，该组合物为昆虫饲料。优选地，所述miRNA模拟物在所述组合物中的浓度为0.02-0.1μg/μL，最优选为0.1μg/μL。与现有防治昆虫(特别是褐飞虱)的主要办法相比，本专利技术通过利用miRNA模拟物作为活性成分，进行昆虫(特别是褐飞虱)的生物防治，具有低剂量高效率的优点，杀虫效果显著。附图说明图1是饲喂miRNA模拟物后褐飞虱的存活率图。图2是饲喂miRNA模拟物后褐飞虱的表型变化图。图3是饲喂miRNA模拟物后褐飞虱的几丁质含量变化图。图4是注射miRNA模拟物后褐飞虱的后代孵化率图。图5是注射miRNA模拟物后褐飞虱的卵巢变化图。图6是注射miRNA模拟物后褐飞虱的CHSA蛋白含量变化图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。如未特别指出，本专利技术实施例中所使用的试剂均可通过商业渠道获得。如未特别说明，本专利技术实施例中所使用的实验技术手段均为本领域技术人员所知晓，故不在此一一赘述其细节。为便于说明，本专利技术将所涉及的miRNA模拟物命名为“miR-2703”(下文以该名称指代)，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。实施例1步骤1：根据核苷酸序列(SEQIDNO：1)合成miR-2703的模拟物(委托广州锐博公司合成)。miR-2703模拟物为化学合成的成熟miRNA双链，能增强内源性miRNA功能，包括一条与目标miRNA成熟体序列一致的序列(如SEQIDNO：1所示，5’-TAGCTTTGATCTGTAGCTAGC-3’)，以及一条与上述miRNA成熟体序列互补的序列。将合成的miRNA模拟物干粉用RNase-free水稀释成储存1μg/μL，分装保存于-20℃。合成miR-2703模拟物的正向引物和反向引物的核苷酸序列如下：正向引物：5’-UAGC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种miRNA模拟物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种miRNA模拟物，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.根据权利要求1所述的miRNA模拟物，其特征在于，合成所述miRNA模拟物的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，合成所述miRNA模拟物的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。3.一种几丁质合成抑制类生物农药，包括作为活性成分的miRNA模拟物，所述miRNA模拟物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。4.根据权利要求1所述的几丁质合成抑制类生物农药，其特征在于，合成所述miRNA模拟物的正向引物的核苷酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文庆，陈洁，李腾超，
申请(专利权)人：中山大学，中山大学深圳研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44