本发明专利技术公开了鳞翅目昆虫几丁质合成酶CHSA‑2b/19b在害虫防治中的应用，本发明专利技术通过充分鳞翅目昆虫注射干涉外显子
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及鳞翅目昆虫几丁质合成酶基因外显子2b、19b在害虫防治中的应用， 具体涉及CHSA-2b/19b影响鳞翅目昆虫蛹翅发育这一功能，从而围绕该基因开展转基因或 抑制剂研发，通过阻碍昆虫翅正常发育，影响其飞翔、求偶和繁殖，达到害虫防治的目的。
技术介绍
昆虫表皮与翅的主要成分是几丁质，几丁质（chitin)是仅次于纤维素的第2 大生物高分子，是一个线型多聚糖复合体，由N-乙酰-β -D葡萄糖胺（β -N-Acetyl-D- glucosamine)通过β-1，4糖苷键聚合而成。在节肢动物中几丁质是表皮外骨豁的重要成 分对节肢动物的生长发育起重要作用，是昆虫外表皮骨骼、气管角质层、中肠围食膜基质等 的组成成分。昆虫几丁质含量随昆虫的生长发育而发生变化，在昆虫蜕皮期含量减少，反 之，新皮生成期含量增加。几丁质合成酶催化有活性的糖供体尿苷二磷酸-Ν-乙酰葡萄糖 胺（uridinedi -pho-sphate N-acetyl glucosamine, UDP-GlcNAc)聚合形成几丁质。因 此几丁质合成酶在昆虫生长发育中起着重要的作用，成为杀虫剂开发的首选靶基因，市场 已有不少该基因抑制剂在使用。 昆虫几丁质合成酶有两类，分别负责表皮和中肠几丁质合成。目前的杀虫剂基 本是根据表皮型几丁质合成酶研发的。中肠型的暂没有发现剪切形式，但表皮型几丁质 合成酶（CHSA)在所有物种中，其cDNA后部皆有一个可变剪切外显子存在，鳞翅目昆虫 的是第19个外显子。研究发现这第19外显子的第一种剪切形式19a主要表达于表皮， 而另一种剪切 19b 主要表达于气管（Qu, M.，Yang, Q.，2011. A novel alternative splicing site of class A chitin synthase from the insect Ostrinia furnacalis - Gene organization, expression pattern and physiological significance. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 41，923-931.)。而在鱗翅目昆虫玉米螟，Qu and Yang (2011)首次发现CHSA的第2个外显子存在两种不同的剪切方式，分别由不同的启动 子启动表达，其中CHSA-2a与其他物种几丁质酶相似，主要负责表皮几丁质的合成。但仍不 清楚CHSA-2b的功能。并且至今也没有报道关于表皮几丁质酶不同剪切方式在昆虫翅发育 中的功能研究。目前市场上的抑制剂都是根据CHSA-2a转录本开发的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供昆虫CHSA_2b的抑制剂在制备杀虫剂中的应用。 本专利技术所采取的技术方案是： 鳞翅目昆虫表皮几丁质合成酶外显子2b和/或19b作为害虫防治靶点的应用。 对鳞翅目昆虫表皮几丁质合成酶外显子2b和/或19b具有抑制作用的物质在害 虫防治中的应用。 进一步的，上述对鳞翅目昆虫几丁质合成酶外显子2b和/或19b具有抑制作用的 物质选自抑制外显子2b和/或19b表达的物质、促进外显子2b和/或19b RNA降解的物 质、抑制外显子2b和/或19b发挥正常作用的物质中的至少一种。 进一步的，上述抑制鳞翅目昆虫几丁质合成酶外显子2b和/或19b表达的物质为 能够对外显子2b和/或19b进行RNA干涉的序列。 进一步的，上述能够对外显子2b和/或19b进行RNA干涉的序列选自SEQ ID N0 : 2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:7 中的至少一种。 进一步的，上述鳞翅目昆虫为斜纹夜蛾、蚕、玉米螟、玉带凤蝶。 -种斜纹夜蛾表皮几丁质合成酶的cDNA序列，其序列如SEQ ID N0 :8所示。 本专利技术的有益效果是： 1)昆虫的生长发育伴随着几丁质降解与生物合成，而人类和其他脊椎动物不存在这一 现象，所以几丁质合成酶作为害虫防治的一个潜在靶位点，具有重要的研究价值。本研究针 对几种鳞翅目昆虫发现的几丁质合成酶外显子2的可变剪切2b，开展功能研究，发现其并 非像2a影响昆虫的表皮形成，而是专一影响翅的发育，因此，我们研究鉴定出的CHSA-2b和 /或19b影响鳞翅目昆虫斜纹夜蛾和家蚕蛹翅发育这一功能，可直接利用其dsRNA对鳞翅目 昆虫进行专一害虫防治。 2)本专利技术研究发现家蚕表皮几丁质合成酶的不同剪切方式在翅的发育中所起的 作用不一样。CHSA外显子2b和19b皆影响翅的发育，以及都有相似的表达谱，两者可能参 与组成一个cDNA，并且为特殊昆虫所特有。因此，可以根据几丁质合成酶含2b和19b的全 长蛋白编码序列发展抗鳞翅目昆虫的抑制剂。昆虫翅对飞行、取食和繁殖具有重要的意义， 因此本专利技术的几丁质合成酶CHSA-2b和/或19b的抑制剂将通过阻碍翅的发育而达到害虫 防治的目的。【附图说明】 图1为分别注射后家蚕成虫的表征，左列为雄虫，右列为雌 虫； 图2为分别注射后家蚕成虫翅放大图，左列为整翅，右列为翅脉 放大图； 图3为分别注射后家蚕成虫翅放大图，左列为整翅，右列为翅脉 放大图； 图4为分别注射后家蚕成虫翅的平均面积 (左图）和注射后翅中他表达水平(右图）； 图5为几丁质合成酶几种剪切方式在家蚕变态发育中的mRNA水平分析；其中，5LD1-5 为5龄1-5天大的幼虫；W0-2为游走期0-2天虫子；PP为预蛹期，P0-6为蛹期0-6天大的 虫； 图6为蜕皮激素对家蚕几丁质合成酶几种剪切方式的诱导作用；其中2Pg、4Pg为蜕皮 激素的剂量，DMS0为对照； 图7为家蚕和斜纹夜蛾几丁质合成酶基因结构图；图中黑框代表了外显子，虚线代表 内含子或启动子区域； 图8为分别注射后家蚕成虫的表征； 图9为玉带凤蝶、玉米螟与家蚕，的序列比对。【具体实施方式】 70 %农业害虫属于鳞翅目，为此本专利技术选择鳞翅目模式昆虫家蚕和害虫斜纹夜蛾 开展了 的克隆与功能分析，确定了该两种昆虫皆存在与玉米螟表皮几丁质合成酶 同样的结构，在外显子2存在两种可变剪切。分别在可变剪切片段区域设计引物，进一步 分析不同剪切方式在翅不同发育时期的表达谱，发现分别含剪切片段％和7助的转录本 β/似-忽与 助皆在蛹翅的第3天方开始表达上调，并且都受昆虫蜕皮激素的诱导， 暗示两者可能共享一个启动子；而β^Μ-为与 的表达谱一致，在成蛹第一天和蛹 后期高表达，并且不受昆虫蜕皮激素的直接诱导。 由于大量的研究表明一般表皮几丁质合成酶（CHSA_2a/19a)负责表皮的几丁质合 成，那么含2b片段的几丁质合成酶（CHSA-2b)与含19b片段的几丁质合成酶（CHSA-1%)的 作用是什么？本专利技术通过注射干涉外显子2b和19b的dsRNA，发现翅脉畸形，变皱与薄，翅 变小，表明含有2b和/或19b的转录本影响家蚕蛹翅的发育，即可变剪切外显子2b和/或 19b与其他外显子组成的转录本影响家蚕蛹翅的发育。 由于并不是所有昆虫表皮几丁质合成酶皆在外显子2和19存在两种不同的剪切 方式，因此可以利用该特点，对鳞翅目昆虫进行β^-忽和/或助RNAi，可以利用转 基因植物的方法，使害虫进食β^Μ-忽和/或助dsRNA，破坏本文档来自技高网...
【技术保护点】
鳞翅目昆虫表皮几丁质合成酶外显子2b和/或19b作为害虫防治靶点的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑思春，徐关峰，刘佳，张婕，李冬冬，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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