本发明专利技术公开了一种重组褐藻胶裂解酶及其工程菌和水解制备褐藻寡糖的方法，根据从海藻中新分离菌株Vibrio sp.BZM-1，筛选得到褐藻胶裂解酶基因—AlgM；构建含有该基因的表达载体pHBM905BDM-AlgM，转化毕赤酵母GS115感受态细胞，获得单拷贝基因工程菌；构建培养验证多拷贝的基因工程菌，高效表达制备重组褐藻胶裂解酶，并用该酶水解海藻酸钠生产褐藻寡糖。含四个拷贝的重组褐藻胶裂解酶基因工程菌GS115/AlgM4(CCTCC No：M2015500)表达水平较高。本发明专利技术重组褐藻胶裂解酶活性高达31000U/mL。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一种新型内切型褐藻胶裂解酶AlgM的基因序列。本专利技术还设及该重 组褐藻胶裂解酶的毕赤酵母基因工程菌的构建W及利用毕赤酵母表达褐藻胶裂解酶的方 法。本专利技术还设及利用该重组褐藻胶裂解酶水解较高浓度海藻酸钢制备褐藻寡糖的方法。
技术介绍
褐藻寡糖是一种最新一代的功能性低聚糖，采用国际领先的分离降解技术得到的 聚合度20W下的褐藻低聚糖，是由P-D-甘露糖醒酸和QA-古罗糖醒酸组成的线型低聚 合物。海藻寡糖分子量低，水溶性强，稳定性高，实验和临床已经发现海藻寡糖具有免疫调 节、降血压、降血脂、降血糖、抗肿瘤、抗凝血及抗病毒等多种生理活性，还可W作为糖尿病、 肥胖症、直肠结肠癌、习惯性便秘患者的疗效食品。在药物研制、功能食品开发、绿色农业等 领域具有广阔的开发应用前景。 近年来，关于低聚糖的研究越来越多，已有多种功能性低聚糖产品投入市场，但目 前大多数低聚糖产品属于普通型的低聚糖，有效成分不足50%。目前主要采用酸降解法和 氧化降解法降解褐藻胶，可W得到聚合度20W下的系列褐藻胶寡糖。而对于酶降解法降 解褐藻胶获得褐藻寡糖的研究才刚刚起步，关键是目前获得的褐藻胶裂解酶的活性普遍不 高，为了提高产品纯度，必须在后续工艺中使用操作复杂成本过高的提纯工序，例如离子交 换色谱法、凝胶过滤色谱法等。酶降解法降解褐藻胶获得褐藻寡糖，关键是褐藻胶裂解酶。 如何寻找高活力的褐藻胶裂解酶，使水解的效果提高，使得产品的纯度提高，使后续提纯工 序简单有效，能低成本地生产高纯度低聚糖，显得尤为重要。 褐藻胶裂解酶按其降解海藻酸盐部位与片段的不同可分为两大类：专一性裂解 1，4糖巧键连接的0 -D-甘露糖醒酸的裂解酶巧CA. 2. 2. 3)和专一性裂解1，4糖巧键连接 的aA-古罗糖醒酸的裂解酶巧C4. 2. 2. 11)。它们分别作用于海藻酸盐的甘露糖醒酸段和 古罗糖醒酸段，通过P-消去反应裂解褐藻胶的糖巧键，在非还原末端产生C4,e不饱和双键 并在230~240nm有强吸收。褐藻胶裂解酶来源广泛，包括海洋藻类、海洋软体动物，刺皮动 物体内和多种微生物（包括海洋细菌、上壤细菌和真菌）。国内现在有许多相关科研单位， 如中国海洋大学、中国科学院海洋研究所、山东大学微生物研究所、浙江大学舟山海洋研究 中屯、、上海海洋大学等广泛进行了褐藻胶裂解酶及其相关内容的研究，但所报道的发酵酶 活性不高，酶解产物纯度低，生产成本高难W工业化。 褐藻胶是褐藻口类藻中提取的一种物质。其主要成分为多聚甘露糖醒酸和多聚古 罗糖醒酸所构成的高分子化合物。褐藻胶广泛存在于巨藻、海带、昆布、鹿角菜、墨角藻和马 尾藻等上百种褐藻的细胞壁中。在我国人工养殖海带非常普遍，产量也很大，所W在我国人 工养殖海带就成了提取褐藻胶的主要原料。褐藻胶的生产加工企业主要集中在山东青岛、 烟台和威海，江苏连云港等地。将褐藻胶利用褐藻胶裂解酶经酶法水解制成褐藻寡糖，有很 好的市场前景，在一般生产中的一般褐藻胶裂解酶活性差，水解效率低，底物浓度低，不能 适应生产的要求。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种重组褐藻胶裂解酶、其工程菌及水解制 备褐藻寡糖的方法，运用基因组文库技术从新分离菌株VibrioSP.BZM-I中筛选高效表达 的褐藻胶裂解酶基因AlgM,构建重组的褐藻胶裂解酶基因，实现重组褐藻胶裂解酶基因在 毕赤酵母中的高效稳定表达，并利用表达的重组褐藻胶裂解酶水解较高浓度海藻酸钢制备 褐澡暑糖。 本专利技术的技术方案如下。 内切型褐藻胶裂解酶AlgM的基因序列，其特征在于： (1)、根据从海藻中新分离的菌株Vibrio SP. BZM-1，建立该菌的基因组文库，筛选 得到褐藻胶裂解酶基因一AlgM ;并进行序列测定，该基因的GenBank登录号为KM655840,该 基因编码545个氨基酸，核屯、序列编码521个氨基酸； 似、根据核屯、序列设计引物：在引物的5'端分别加上接头GTCA和GGCCA，引物序 列为： AlgM-F ：GTCAATGAAACATAAAATCGTCAAAACATTA AlgM-R ：GGCCATTATTTACCTTGATAGGTGCCGTG；[001引并通过PCR扩增所述褐藻胶裂解酶基因：扩增条件为94°C3min，94°C30s， 55°C30s，72°CImin，共 30 个循环，最后 72°C3min。 含有重组褐藻胶裂解酶基因AlgM的表达载体的构建，其特征在于：把重组褐 藻胶裂解酶基因AlgM克隆到新型毕赤酵母表达载体PHBM905BDM，首先通过PCR扩增褐 藻胶裂解酶基因AlgM序列，在dTTP保护下，用T4DNA聚合酶处理后，然后定向插入到经 CpoI和NotI双酶切除去kan抗性基因的载体PHBM905BDM上，获得重组质粒，命名为 I)皿M905抓M-AlgM。 一种利用重组褐藻胶裂解酶制备的工程菌，其特征在于：保藏编号CCTCCNo: M2015500,名称为己斯德毕赤酵母GS115/AlgM4。 所述的工程菌水解制备褐藻寡糖的方法，其特征在于： (1)、发酵褐藻胶裂解酶AlgM:将菌株毕赤酵母GSl15/AlgM4置于100mLBMGY培养 基中，28°C~30°C，260巧m培养40~50h，至孤6。。为20~30,于室溫离屯、5000巧m，5min， 收集菌体；[001引 （2)、将菌体转移至100mLBMMY培养基中，28°C~30°C，260巧m培养，每隔1化补 加甲醇；得到上清液即为粗酶液； (3)、利用得到的粗酶液水解海藻酸钢制备褐藻寡糖：设定水解底物的浓度 10 %~30 %，加入溫度为30~40 °C的100mL抑在8~9的碱性水做溶剂，一边少量添加 底物，逐步递增底物的量达到预定的量，一边少量逐步添加粗酶液1000ul-3000ul，添加底 物和酶量比例为Ig:lOOul，均匀揽拌；保持溫度稳定在30~40°C，直至水解浓度达到每 100mL含20g海藻酸钢； (4)、水解完成后，将反应液进行离屯、去残渣，取上清过滤，超滤，进行真空喷雾干 燥，得到褐藻寡糖成品。 所述的工程菌水解制备褐藻寡糖的方法，其特征在于：底物和酶量比例为 lg:50-100ul〇 利用所述的工程菌水解制备褐藻寡糖的方法，其特征在于：所述底物为褐藻胶、褐 藻酸和褐藻酸盐中的一种或者任意比例的两种W上。 所述的工程菌的制备方法，其特征在于： (1)、表达重组褐藻胶裂解酶的毕赤酵母工程菌的筛选：将用限制性内切酶SalI 线性化的pHBM905BDM-AlgM，转化毕赤酵母GS115感受态细胞，得到单拷贝数的重组菌株； (2)、将获得的单拷贝数的重组菌株接种在含有1. 0%的海藻酸钢的平板上，从中 筛选出水解圈最大的菌株，提取该转化子基因组； (3)、基于Biobrick方法，将载体PHBM905BDM经过酶切和连接，得到多个拷贝表达 盒式结构串联重复的重组质粒； (4)、将多个拷贝表达盒式结构串联重复的重组质粒线性化，转化毕赤酵母GS115 感受态细胞，得到含有可控拷贝数的重组菌株；拷贝数n= 2、3、4……，n为自然数；将四拷 贝重组菌株命名为己斯德毕赤酵母GS115/AlgM4。 本专利技术的积极效当本文档来自技高网...
【技术保护点】
内切型褐藻胶裂解酶AlgM的基因序列，其特征在于：(1)、根据从海藻中新分离的菌株Vibrio sp.BZM‑1，建立该菌的基因组文库，筛选得到褐藻胶裂解酶基因—AlgM；并进行序列测定，该基因的GenBank登录号为KM655840，该基因编码545个氨基酸，核心序列编码521个氨基酸；(2)、根据核心序列设计引物：在引物的5’端分别加上接头GTCA和GGCCA，引物序列为：AlgM‑F：GTCAATGAAACATAAAATCGTCAAAACATTAAlgM‑R：GGCCATTATTTACCTTGATAGGTGCCGTG；并通过PCR扩增所述褐藻胶裂解酶基因：扩增条件为94℃3min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，共30个循环，最后72℃3min。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：武玉永，姚庆收，谭秀华，马朋，秦加阳，孙业盈，
申请(专利权)人：滨州医学院，
类型：发明
国别省市：山东;37
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