一种从南极磷虾中提取高纯度海洋磷脂的方法技术

本发明专利技术提供一种从南极磷虾中提取高纯度海洋磷脂的方法，其步骤包括：将南极磷虾匀浆，复合酶酶解；固液分离，固体部分加入碱性乙醇液超声辅助提取；水沉除油后，进行聚苯乙烯凝胶柱层析；冰乙醇液洗涤，得到高纯度磷脂。本发明专利技术原料采用菠萝蛋白酶和几丁质酶复合酶酶解，用碱性乙醇液进行高效提取，提高了磷脂的提取效率，全程温度不超过50℃，不损失磷脂的生理活性，提取的磷脂纯度高于95％，较现有方法有显著提高。

Method for extracting high-purity marine phospholipid from Antarctic krill

The present invention provides a method for extracting high purity phospholipids from Marine Antarctic krill, which comprises the following steps: Antarctic krill homogenate, enzymolysis; solid-liquid separation, the solid part of adding alkaline ethanol solution with ultrasonic assisted extraction; oil water sink, for polystyrene gel column chromatography; ethanol liquid washing, high the purity of lecithin. The invention adopts raw pineapple protease and chitinase of enzymolysis, efficiently extracted with alkaline ethanol solution, improve the efficiency of extraction of phospholipids, the whole temperature does not exceed 50 degrees, no loss of physiological activity of phospholipids, phospholipid extraction purity higher than 95%, significantly higher than that of the existing methods.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种从南极磷虾中提取海洋磷脂的方法，属于海洋活性物质

技术介绍
南极磷虾是一种生活在南大洋的甲壳类浮游动物，是地球上最大的单种生物资源之一，其现存量高达6.5～10.0亿吨，成熟虾年产量为3～5亿吨，年可捕获量可达1.3亿吨，使其成为巨大的潜在渔业资源。我国目前已经将南极磷虾列为今后远洋渔业发展的主要开发品种之一。南极磷虾中磷脂的含量丰富，其磷脂的脂肪酸组成以EPA和DHA为主，含量占磷脂中脂肪酸总量的40％以上。因此，南极磷虾中高纯度磷脂的制备必然是深加工南极磷虾中最关键的技术之一。磷脂是一类含磷酸根的类脂化合物，是组织细胞的基本组成成分，包括鞘磷脂和甘油磷脂两大类。前者主要见于高等动物的红细胞膜中，后者在动物肝脏、脑及卵巢中含量丰富。磷脂不仅具有较高的营养价值，还具有生理调节机能，促进人体新陈代谢、增强免疫力、预防疾病等作用。现在，美国、欧洲、日本等发达国家已将磷脂应用于临床中，预防脑、心、肝、肿瘤等疾病。此外，磷脂还具有乳化、润湿、抗氧化、改善物料粘度、防止淀粉老化等特征，使其在食品工业、轻工、化工等领域有着广泛的应用。目前，市场上磷脂产品主要是大豆磷脂和蛋黄磷脂。大豆磷脂虽然存在广泛，价格低廉，但其脂肪酸组成相对简单，不饱和程度较低；蛋黄磷脂的磷脂酰胆碱纯度较高，但生产成本高，缺少对人体有益的多不饱和脂肪酸。海产动物来源的磷脂因其侧链中富含二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等丰富的ω-3多不饱和脂肪酸，具有显著的降血脂、抗衰老、促进神经传导、提高大脑活力、预防心脑血管疾病，保肝、增强免疫力、抑制肿瘤细胞生长等多种功能，开发利用前景广阔。国内外对磷脂的提取纯化进行了很多的研究，常用的方法有：溶剂提取法、吸附色谱法、超临界萃取法、酶解法、无机盐复合沉淀法、微波提取法、膜分离法等。但是，这些方法存在很多的技术缺陷：原料方面主要从大豆和蛋黄中提取，从而和人类抢夺食物资源；超临界萃取法、膜分离法等工艺较为复杂，操作成本高；无机盐沉淀法引入金属离子(Zn2+、Cd2+等)，具有一定的毒性，影响磷脂的质量等等。目前，针对南极磷虾中提取的磷脂多以磷虾油的产品形式存在，提取方法大多为酶解法和溶剂提取法，其得到的磷脂含量较低，最高仅达50～60％。专利CN102603790A利用90～100％乙醇提取后，正己烷萃取、丙酮沉淀的方式得到高纯度磷脂酰胆碱。专利CN103509047A将南极磷虾头进行煎煮和无水乙醇提取后，经膜分离、硅胶或大孔树脂柱层析获得磷脂酰胆碱产品。但是，以上均是针对磷脂类的单一成分，并非是存在于南极磷虾中的种类丰富的磷脂组合。专利CN102559368A将新鲜南极磷虾低温自溶后进行酶解，再用乙醇进行提取得到初步的磷脂产品。专利CN104531332A利用乙酸乙酯和正丁醇组成的混合溶剂提取南极磷虾中的总磷脂，其磷脂含量为27～45％之间。因此，进一步开发研究从南极磷虾中提取高纯度磷脂的方法，对于扩大海洋磷脂的生产来源和提升南极磷虾的利用价值具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种操作简便，安全环保的从南极磷虾中提取高纯度海洋磷脂的方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供的技术方案是，一种从南极磷虾中提取高纯度海洋磷脂的方法，步骤如下：1)将南极磷虾加入0.5～2倍量水，匀浆，调节pH至6.5，40～45℃条件下加入复合酶水解2～4小时；2)酶解液固液分离，固体部分经85～100％的碱性乙醇液超声辅助提取2次，每次15～30min，提取液合并后，进行减压抽滤和减压浓缩；3)搅拌并加热提取浓缩物，向提取浓缩物中缓慢、均匀的掺入蒸馏水，掺水时间为15min，待絮状物沉淀出现停止搅拌，静置12h，离心，沉淀物即为总磷脂；4)总磷脂用少量二氯甲烷溶解后，过滤，经聚苯乙烯凝胶柱层析，环己烷-乙酸乙酯洗脱剂洗脱，收集洗脱液，薄层色谱检测后，合并洗脱液，减压浓缩；5)浓缩物经冰乙醇液洗涤，干燥，得到高纯度磷脂。具体地，步骤如下：1)将南极磷虾加入0.5～2倍量水，匀浆5～20min，调节pH至6.5，40～45℃条件下加入原料重量0.5～1％的复合酶(菠萝蛋白酶和几丁质酶)水解2～4小时；2)酶解液固液分离，固体部分按照质量体积比1:6～1:12加入重量百分比浓度为85～100％的碱性乙醇液超声辅助提取2次；提取液合并后，经减压抽滤和减压浓缩得提取浓缩物；3)以每分钟60转的速度搅拌提取浓缩物，加热其温度至35℃，降低搅拌速度至每分钟25转，缓慢、均匀的掺入蒸馏水，掺水时间为15min，掺水后，搅拌速度恢复至每分钟60转，待絮状物沉淀出现停止搅拌，静置12h，离心，沉淀物即为总磷脂；4)总磷脂用少量二氯甲烷溶解后，过滤，经Bio-BeadsS-X8聚苯乙烯凝胶柱层析，环己烷洗脱除去小极性杂质后，环己烷-乙酸乙酯按1:1的比例洗脱，洗脱速度为每小时0.5～1.5倍柱体积；收集洗脱液，薄层色谱检测后，合并洗脱液，减压浓缩；5)浓缩物按照质量体积比1:0.5～1:2加入55～65％的冰乙醇液洗涤，干燥，得到高纯度磷脂。所述的南极磷虾原料为新鲜或冷冻的南极磷虾。所述的碱性乙醇液为向乙醇液中添加碱性物质，使其pH达到9.0～10.0；所述的碱性物质为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠或醋酸钠等。所述步骤1)复合酶中菠萝蛋白酶和几丁质酶的重量比为1:2。所述步骤2)碱性乙醇液中的乙醇比例优选90～95％；超声功率为30～40KHZ，超声温度为25～40℃，每次超声时间为15～30min。所述步骤3)蒸馏水的掺入量为提取浓缩物重量的3％，水温为30℃。所述步骤4)薄层分析检测条件为：正相GF254硅胶薄层板；展开剂为10:11.3:11.7:2.7的二氯甲烷-无水乙醇-三乙胺-水体系；显色剂为10％浓硫酸-乙醇溶液；110℃加热显色。所述步骤2)和4)中所述的减压浓缩温度为40～50℃。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1)本专利技术方法得到的南极磷虾中磷脂纯度极高，磷脂的纯度在95％以上。2)在提取过程中通过向乙醇中添加碱性物质，对磷脂起到增溶作用，提高了收率，提取效率远高于现有常规方法。3)原料前处理过程中采用菠萝蛋白酶和几丁质酶复合的方式进行酶解，有利于磷脂更高效率的释放，提高了磷脂的提取率。4)提取过程中温度均控制在50℃以下，产品活性功能不受损失，尤其适合海洋磷脂(富含ω-3多不饱和脂肪酸侧链)的提取。5)提取过程操作简便，提取效率高。柱层析死吸附较少，填料机械强度好，可重复使用。附图说明图1为本专利技术对比例2用不同含醇量乙醇液提取得到的磷脂纯度图。图2为磷酸二氢钾的标准曲线。具体实施方式下面结合具体试验方法和附图对本专利技术的技术方案及其所产生的技术效果进行进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本专利技术，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所作的任何变换或替换，均属于本专利技术的保护范围。实施例1称取冷冻保存的南极磷虾100g，加入50mL水，粉碎匀浆18min，用醋酸-醋酸钠缓冲液调节pH至6.5，加热至40℃，加入复合酶0.5g，水解约3h；将酶解液离心，固体部分经1000mL93％的乙醇液(醋酸钠调其pH为9.0)，30℃下超声提取2次，每次30本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从南极磷虾中提取高纯度海洋磷脂的方法，其特征是，步骤如下：1)将南极磷虾加入0.5～2倍量水，匀浆，调节pH至6.5，40～45℃条件下加入复合酶水解2～4小时；2)酶解液固液分离，固体部分经85～100％的碱性乙醇液超声辅助提取2次，每次15～30min，提取液合并后，进行减压抽滤和减压浓缩；3)搅拌并加热提取浓缩物，向提取浓缩物中缓慢、均匀的掺入蒸馏水，掺水时间为15min，待絮状物沉淀出现停止搅拌，静置12h，离心，沉淀物即为总磷脂；4)总磷脂用少量二氯甲烷溶解后，过滤，经聚苯乙烯凝胶柱层析，环己烷‑乙酸乙酯洗脱剂洗脱，收集洗脱液，薄层色谱检测后，合并洗脱液，减压浓缩；5)浓缩物经冰乙醇液洗涤，干燥，得到高纯度磷脂。

【技术特征摘要】
1.一种从南极磷虾中提取高纯度海洋磷脂的方法，其特征是，步骤如下：1)将南极磷虾加入0.5～2倍量水，匀浆，调节pH至6.5，40～45℃条件下加入复合酶水解2～4小时；2)酶解液固液分离，固体部分经85～100％的碱性乙醇液超声辅助提取2次，每次15～30min，提取液合并后，进行减压抽滤和减压浓缩；3)搅拌并加热提取浓缩物，向提取浓缩物中缓慢、均匀的掺入蒸馏水，掺水时间为15min，待絮状物沉淀出现停止搅拌，静置12h，离心，沉淀物即为总磷脂；4)总磷脂用少量二氯甲烷溶解后，过滤，经聚苯乙烯凝胶柱层析，环己烷-乙酸乙酯洗脱剂洗脱，收集洗脱液，薄层色谱检测后，合并洗脱液，减压浓缩；5)浓缩物经冰乙醇液洗涤，干燥，得到高纯度磷脂。2.如权利要求1所述的从南极磷虾中提取高纯度海洋磷脂的方法，其特征是，具体地，步骤如下：1)将南极磷虾加入0.5～2倍量水，匀浆5～20min，调节pH至6.5，40～45℃条件下加入原料重量0.5～1％的复合酶水解2～4小时；2)酶解液固液分离，固体部分按照质量体积比1:6～1:12加入重量百分比浓度为85～100％的碱性乙醇液超声辅助提取2次；提取液合并后，经减压抽滤和减压浓缩得提取浓缩物；3)以每分钟60转的速度搅拌提取浓缩物，加热其温度至35℃，降低搅拌速度至每分钟25转，缓慢、均匀的掺入蒸馏水，掺水时间为15min，掺水后，搅拌速度恢复至每分钟60转，待絮状物沉淀出现停止搅拌，静置12h，离心，沉淀物即为总磷脂；4)总磷脂用少量二氯甲烷溶解后，过滤，经Bio-BeadsS-X8聚苯乙...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘可春，李晓彬，韩利文，何秋霞，楚杰，王荣春，陈锡强，张轩铭，王莹，靳梦，
申请(专利权)人：山东省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37