本发明专利技术公开了一种褐色橘蚜几丁质合成酶基因，其序列如SEQ ID NO:3所示；还公开了一种褐色橘蚜几丁质合成酶基因的dsRNA，其序列如SEQ ID NO:6所示；还公开了一种褐色橘蚜几丁质合成酶基因的dsRNA的合成方法，包括如下步骤：提取褐色橘蚜的总RNA，反转录成为cDNA作为扩增模板，以序列为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5为引物进行PCR扩增，电泳后回收产物，以胶回收产物为模板合成得到褐色橘蚜几丁质合成酶基因的dsRNA。本发明专利技术鉴提供的几丁质合成酶基因的dsRNA，基因沉默效率高，基因干扰后褐色橘蚜有明显表型变化，在研发新型杀虫剂方面有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及昆虫的生长发育调控和基因工程领域，特别涉及一种褐色橘蚜几丁质 合成酶基因及其dsRNA。
技术介绍
褐色橘姐（Toxoptera citricida)是一种世界性的柑橘害虫，同时是柑橘衰退病 病毒的主要传播媒介，对柑橘产量和品质影响较大，目前化学防治仍是控制褐色橘蚜的重 要措施。化学农药施用不当，不仅影响果品安全，同时还会导致严重的抗药性。 RNA干扰（RNAinterference，RNAi)是近年来发现的一种重要基因沉默手段，是 指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA，Double-strandedRNA，双链核糖核酸） 诱发的、同源RNA高效特异性降解的现象，是通过dsRNA的介导特异性的降解对应序列的 mRNA。由于使用RNAi技术可以特异性抑制特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索 基因功能和基因治疗领域。 几丁质是广泛存在于自然界的一种含氮多糖类生物性高分子，主要的来源为虾、 蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官，以及真菌类的细胞壁等。在昆虫中主要存 在于昆虫表皮层中的上表皮以及消化道的围食膜基质中，昆虫的变态发育依赖于体内几丁 质生物合成和降解的精确控制。几丁质在生物体内的合成是由一系列酶催化完成的，其中 几丁质合成酶（chitin synthase，CHS)在合成的最后一步起着关键作用，所以几丁质合成 酶的缺失可影响到昆虫的正常生长发育，由于人类、高等动物、植物并不含有几丁质，故几 丁质合成途径作为害虫的靶标相对安全，基于该途径研发新型的杀虫剂，应用于害虫的防 治具有很大的潜力，但是目前针对褐色橘蚜几丁质合成酶的相关研究较少，也未见针对褐 色橘蚜几丁质合成酶基因的dsRNA的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于克服已有技术的缺陷，提供一种褐色橘蚜几丁质 合成酶基因及其dsRNA。 本专利技术的技术方案如下： -种褐色橘蚜几丁质合成酶基因，其序列如SEQIDN0:3所示。 -种褐色橘蚜几丁质合成酶基因的dsRNA，其序列如SEQ ID NO: 6所示。 -种褐色橘蚜几丁质合成酶基因的dsRNA的合成方法，包括如下步骤：提取褐色 橘蚜的总RNA，反转录成为cDNA作为扩增模板，以序列为SEQIDN0:4的上游引物和以序列 为SEQIDN0:5的下游引物进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳后回收产物，以胶回收产 物为模板合成得到褐色橘蚜几丁质合成酶基因的dsRNA。 在上述技术方案中，PCR扩增时25μ1的PCR反应体系包括：浓度为800-1200ng/ μ1 的cDNA模板 0· 5μ1，浓度为 0· 15-0. 25μΜ的上、下游引物各 1μ1，PrimeSTARMax Premix12. 5μ1以及去核酸酶水10μ1。 在上述技术方案中，PCR反应条件为：95°C预变性3min;95°C变性30s、60°C退火 10s、72°C延伸5min，共35个循环；72°C条件下延伸lOmin。 本专利技术的有益效果是：本专利技术鉴定得到褐色橘蚜几丁质合成酶基因序列，并根据 该序列得到几丁质合成酶基因的dsRNA，可以应用于对褐色橘蚜进行RNA干扰从而起到防 治褐色橘蚜的效果。通过实验验证，该dsRNA基因沉默效率高，基因干扰后褐色橘蚜有明显 表型变化，解决了褐色橘蚜目前没有有效的几丁质合成酶基因的dsRNA的问题，在研发新 型杀虫剂方面有很好的应用前景。【附图说明】 图1为褐色橘蚜CHS基因在NCBI中Protein Blast比对图。 图2为褐色橘蚜及其它昆虫几丁质合成酶系统发育树图。 图3为本专利技术实施例中的饲喂dsRNA的装置。 图4为褐色橘蚜饲喂CHS基因的dsRNA后的CHS基因相对表达量，其中PBS表示 对照组，dsTCiCHS表示实验组。 图5为褐色橘蚜饲喂CHS基因的dsRNA后的累积蜕皮率，其中PBS表示对照组， dsTCiCHS表示实验组。 图6为褐色橘蚜饲喂CHS基因的dsRNA后的累积死亡率，其中PBS表示对照组， dsTCiCHS表示实验组。 图7为褐色橘!??牙伺喂CHS基因的dsRNA后表型表现图；其中1为实验组的不能正 常蜕皮死亡的褐色橘蚜，2为对照组的能够正常蜕皮的褐色橘蚜。【具体实施方式】 本专利技术实施例所用化学试剂来源如下： LATaq MIX(Takara公司，日本） TRIzol kit (Invitrogen公司，美国） RNeasy Plus Micro Kit (QIAGEN公司，德国） PrimeSTAR Max Premix(Takara公司，日本） 胶回收纯化试剂盒（Takara公司，日本） Transcript Aid T7 High Yield Transcription Kit(Thermo fisher Scientific 公司，美国） Perfect real time RT reagent (Takara公司，日本） GoTaCj1? qPCR Master Mix(Promega公司，美国） TranscriptAid Enzyme Mix (Thermo fisher Scientific公司，美国） ATP/CTP/GTP/UTP Mix (Thermo fisher Scientific公司，美国） PrimeScriptRT Enzyme Mix I (Thermo fisher Scientific公司，美国） Oligo dT Primer (Thermo fisher Scientific公司，美国） Random 6 mers (Thermo fisher Scientific公司，美国） 实施例一、褐色橘蚜几丁质合成酶基因序列鉴定 1)从褐色橘蚜转录组数据（西南大学昆虫学与害虫控制重点实验室提供）中查 找可能的几丁质合成酶Unigene序列，通过tBlastn，在转录组当中查找到一条unigene序 列。 2)利用RNA提取试剂盒RNeasyPlusMicroKit按照使用说明提取褐色橘蚜的总 RNA，然后利用反转录试剂盒PerfectrealtimeRTreagent按照使用说明将lyg总RNA 反转录成为cDNA。 3)以上述得到的cDNA为模板，设计全长扩增引物，利用上下游引物CHS-A和 CHS-S进行PCR扩增；PCR条件为：95°C预变性3min;95°C变性30s、60°C退火10s、72°C延伸 5min，共35个循环；72°C条件下延伸lOmin。PCR反应体系共25μ1，包括：浓度为lOOOng/ μ1 的cDNA模板 1μ1，浓度为(λ15-0. 25μΜ的上下游引物各 1μ1，LATaqMIX(λ25μ1， 10XBuffer(Mg2+plus) 3μ1，dNTP4μ1 以及去核酸酶水 14. 75μ1 ;引物CHS-A(如SEQID NO: 1所示）和CHS-S(如SEQIDNO:2所示）的序列如下：CHS-A：ATGACGTCTCTCCAGCGT, CHS-S：TCAGTTAATGGCGTGCAT〇 4)将PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳中进行分离，得到4700bp左右的条带，将PCR 产物送测序公司进行测序。 5)将测本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种褐色橘蚜几丁质合成酶基因，其特征在于，序列如SEQ ID NO:3所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王进军，尚峰，丁碧月，熊英，魏冬，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;85
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