用于miRNA抑制剂和模拟物的化学修饰基序制造技术

本发明专利技术提供了具有化学模式的多核苷酸，其提供了相对于它们作为miRNA抑制剂或miRNA模拟物的用途而言的改进的稳定性、效力和/或毒性。本发明专利技术还提供了包含该多核苷酸的药物组合物和制剂，以及治疗患有miRNA或mRNA表达相关病症的患者的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及微小RNA (miRNA或miR)抑制剂及模拟物的化学基序，且尤其是涉及化学修饰的miRNA有义和反义多核苷酸，当施用于患者时，所述多核苷酸在效力、稳定性和/或毒性方面具有优势。
技术介绍
微小RNA(miR)涉及多种生物过程，包括心脏功能的调节和维持(参见 Chien KR， Molecular Medicine MicroRNAs and the tell-tale heart, Nature 447，389-390 (2007) ) 因此，miR代表了一类相对新的用于诸如心脏肥大、心肌梗死、心力衰竭、血管损伤以及病理性心脏纤维化等病症的治疗靶标。miRNA是长度为约18至约25个核苷酸的小的、非蛋白编码RNA，其通过以下方式作为靶mRNA的阻遏剂发挥作用当它们的序列精确互补时促进靶mRNA的降解，或当它们的序列含有错配时则抑制翻译。成熟的miRNA链掺入RNA诱导沉默复合物(RISC)中，在这里其通过碱基对互补性而与其靶RNA关联。可通过反义多核苷酸或通过模拟miRNA功能的多核苷酸(“miRNA模拟物”)治疗性地靶向miRNA功能。然而，当将多核苷酸引入完整细胞时，它们受到核酸酶的攻击并降解，从而导致活性的损失。尽管已制备了多核苷酸类似物试图避免它们的降解，例如通过2’取代的方式(B. Sproat 等，Nucleic AcidsResearch 17 (1989), 3373-3386),但修饰通常影响多核苷酸预期生物作用的效力。在每种情况下，此类降低的效力可能是由于该修饰的多核苷酸不能与靶RNA形成稳定的二聚体，和/或丧失了与细胞机制的相互作用。需要用于改进miRNA抑制剂和miRNA模拟物的稳定性、效力和/或毒性概况的化学模式或基序，用于有效地靶向治疗背景中的miRNA功能。专利技术概述本专利技术提供了多核苷酸，所述多核苷酸具有相对于它们作为miRNA抑制剂或miRNA模拟物的用途而言提供改进的稳定性、效力和/或毒性的化学模式。本专利技术还提供了包含该多核苷酸的药物组合物或制剂，以及治疗患有miRNA相关或mRNA表达相关病症的患者的方法。在一个方面，本专利技术提供了具有一个或多个在2’位置的核苷酸修饰，和至少一个末端或“帽”修饰的多核苷酸。该化学修饰基序可消除对完全硫代磷酸酯连接的多核苷酸和/或全长反义或有义miRNA序列的需求。该多核苷酸是miRNA抑制剂或miRNA模拟物，并且如本文所显示的那样，其提供了与未修饰的多聚核糖核苷酸相比和/或与其他可能的多核苷酸修饰相比经改进的效力。例如，该多核苷酸可以是具有如本文所述2’修饰之一或组合的miRNA抑制剂或miRNA模拟物，诸如选自O-烷基(0-alkyl)(例如，0-甲基或“OMe”)、卤素(例如，氟)、脱氧(H)和锁核酸(locked nucleic acid)的那些，以及在一些实施方案中,基本上所有、或所有的核苷酸2’位置均被修饰。在一些实施方案中，末端或帽修饰可以是5’和/或3’硫代磷酸酯单磷酸酯(phosphorothioate monophosphate)和/或无碱基部分,或本文描述的其他帽结构。该多核苷酸不需要完全是硫代磷酸酯连接的，但是在此类连接存在时，此连接可例如置于5’末端的两个末端核苷酸和3’末端的两个末端核苷酸之间。该核苷酸序列相对于成熟miRNA而言可以是全长的，或全长反义miRNA (成熟形式)，但在一些实施方案中，该多核苷酸包含截短的miRNA序列或截短的miRNA反义序列。此类修饰的截短序列可显示出高水平的效力，甚至当与更长的(未修饰或常规修饰的)对应物相比也如此。该多核苷酸可以是具有与miR-15b、miR-21、miR-208a或本文描述的其它(的全部或部分)互补的反义序列的antagomir。在第二个方面，本专利技术提供了包含本专利技术多核苷酸和可药用载剂的药物组合物或制剂。可将该药物组合物配制为各种可药用形式，包括胶体分散体系、大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠子、水包油乳剂、胶束、混合胶束或脂质体。该组合物可包括与胆固醇和其他 分子(诸如靶向配体)的缀合物，用于将该多核苷酸递送至靶标哺乳动物细胞。在第二方面，本专利技术提供了用于治疗具有miRNA相关或mRNA表达相关病症的患者的方法。例如，该病症可以是心脏肥大、心肌梗死、心力衰竭、血管损伤以及病理性心脏纤维化的一种或多种。此类病症通过施用本专利技术的多核苷酸或组合物而得以治疗、预防或改善。因此，本专利技术提供了本专利技术的经修饰的多核苷酸和组合物用于治疗miRNA相关或mRNA表达相关病症的用途。附图说明图I是示出了示范性miRNA修饰模式的表格。所示序列是成熟miR15b的反义序列(全长或截短的)。简写的描述提供于表3中。每一示例性RNA的“别名”包括:miRNA靶标(例如，15b) ;2’结构(0-甲基、“OMe”;或0-甲基和氟、“Me/F”;或0-甲基和脱氧、“Me/!1”;或锁核酸“11^”)；多核苷酸的大小(代表全长的FL或16-聚体)；以及在末端或内部的连接的结构，包括P0为磷酸二酯连接的，PS为硫代磷酸酯连接的，PS EO为每隔一个为硫代磷酸酯连接的，PS EC为硫代磷酸酯末端-帽，无碱基，以及POS为5’和3’硫代磷酸酯单磷酸酯。图2显示了应用双-萤光素酶测试法在Hela细胞中两个浓度即10nM(每一组中的左柱)和0. InM(每一组中的右柱)的图I中修饰的多核苷酸的体外测试结果。萤光素酶比率越大，抑制剂的效力越好。通过长度即16-聚体和全长对结果分组。高性能的化学物显不于表4中。图3显示了在双萤光素酶测试法中，IOnM(每组的左柱)和0. InM(每组的右柱)的硫代磷酸酯单磷酸酯修饰的多核苷酸与磷酸二酯或硫代磷酸酯骨架直接相比较的结果。PO是磷酸二酯连接的，PS是硫代磷酸酯连接的，以及PO POS是在3’和5’末端均有末端硫代磷酸酯单磷酸酯的磷酸二酯连接。图4显不了在小鼠中用来自表5的多核苷酸5-14敲低miR_15b。测定了肝脏(每组的左柱)和心脏(每组的右柱)中的miR-15b丰度，并与用盐水注射的小鼠相比较。图5显示了在新生大鼠心肌细胞中用修饰的反义多核苷酸抑制miR_208a。图5中的结果是PMHC表达的定量PCR。左柱显示了 IOOnM抑制剂的结果，以及右柱显示了 InM抑制剂的结果。图6显示了在双萤光素酶测试法中通过具有各种修饰的反义多核苷酸抑制miR-21。图7显示了以所示剂量注射大鼠后4种不同的修饰的miR_15b反义多核苷酸的体内组织分布。专利技术详述本专利技术提供了多核苷酸，所述多核苷酸具有相对于它们作为miRNA抑制剂或miRNA模拟物的用途而言提供改进的稳定性、效力和/或毒性的化学模式。本专利技术还提供了包含该多核苷酸的药物组合物或制剂，以及治疗患有miRNA相关或mRNA表达相关病症的患者的方法。 修饰的多核苷酸该多核苷酸具有一个或多个在2’位置的核苷酸修饰，以及至少一个末端修饰或“帽”，如下文所示。该多核苷酸是miRNA抑制剂或miRNA模拟物，并且展示出与未修饰的多聚核糖核苷酸相比、和/或与其他可能的多核苷酸修饰相比的经改进的效力。如本文所述,“miRNA抑制剂”是具有与成熟单链miRNA或其部分反义(互补或如本文所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：C亚马达，WS马沙尔，
申请(专利权)人：米拉根医疗公司，
类型：发明
国别省市：