在网粘菌门微生物中产生蛋白质制造技术

本发明专利技术涉及网粘菌门的重组细胞和微生物以及它们在异源蛋白质生产中的应用，与从重组宿主细胞和微生物有效产生和任选地分泌多肽有关的新颖启动子、终止子和信号序列也包含在本发明专利技术中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在网粘菌门微生物中产生蛋白质专利技术背景专利
本专利技术涉及网粘菌门(Labyrinthulomycota)的重组细胞和微生物以及它们在异源蛋白质生产中的应用，与从重组宿主细胞和微生物有效产生和任选地分泌多肽有关的新颖启动子、终止子和信号序列也包含在本专利技术中。
技术介绍
生物技术和分子生物学的发展使得原先只能从人或动物的组织、血液或尿液样本中提取的蛋白质，能够在微生物、植物和动物细胞中产生。目前商品化生物产品通常在哺乳动物细胞如CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)中，或在微生物细胞如酵母或大肠杆菌细胞系 中产生。与已有的动植物细胞培养体系相比，通过微生物发酵产生蛋白质有若干优势，例如，基于微生物发酵的过程有以下特性(I)快速产生高浓度的蛋白质；(2)能够使用无菌的、严格控制的产生条件，(比如优良制造标准(GMP)生产条件)；(3)能够使用简单的、化学组分明确的生长培养基以便简化发酵和减少杂质；(4)没有人类或动物病原体污染；(5)容易回收蛋白质(如从发酵培养基中分离)。此外，与细胞培养设施相比，发酵设备的构建成本通常更低。美国公开号2003/0166207(即现在的美国专利7，001, 772)首次披露了适合转化破囊壶菌(包括裂殖壶菌属(Schizochytrium)在内)的重组构建体。此外，该公开文献还披露了裂殖壶菌的乙酰乳酸合酶的核酸及氨基酸序列、乙酰乳酸合酶的启动子和终止子区域、a-微管蛋白质的启动子、聚酮合酶(PKS)体系的启动子以及脂肪酸去饱和酶的启动子。随后出版的美国公开号2006/0275904及2006/0286650(通过引用全文纳入本文)进一步披露了裂殖壶菌的肌动蛋白、efl a (延长因子la)以及甘油醛_3_磷酸脱氢酶(GAPDH)的启动子和终止子的序列。持续需要鉴定用于在破囊壶菌微生物中表达蛋白质的其它调控元件，包括差异表达的调控元件，例如，在不同的时间点、或在一定的培养条件下、或在化学或环境因素的刺激下会应答的元件。还需要鉴定能够有效指导蛋白质从网粘菌门微生物和破囊壶菌目(Thraustochytriales)微生物(比如裂殖壶菌属和其它一些破囊壶菌)分泌出来的分泌信号系列。专利技术概述本专利技术涉及一种分尚的核酸分子，其包含多核苷酸序列SEQ ID NO :3。本专利技术也涉及一种分尚的核酸分子，其包含多核苷酸序列SEQ ID NO :4。本专利技术也涉及一种分离的核酸分子，其包含编码某多肽的多核苷酸序列，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO :1。在一些实施方式中，所述的多核苷酸序列包含SEQ ID NO2。本专利技术也涉及一种分离的核酸分子，其包含编码某多肽的多核苷酸序列，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO :37。在一些实施方式中，所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO:38。本专利技术也涉及一种分尚的核酸分子，其包含多核苷酸序列SEQ ID NO :42。在一些实施方式中，所述多核苷酸序列包含SEQ ID N0:43。本专利技术也涉及一种分离的核酸分子，其包含多核苷酸序列SEQ ID NO :44。在一些实施方式中，所述多核苷酸序列包含多核苷酸序列SEQ ID N0:45。本专利技术也涉及一种分尚的核酸分子，其包含多核苷酸序列SEQ ID NO :46。本专利技术也涉及一种分离的核酸分子，其包含与上述的任何一个多核苷酸序列完全互补的多核苷酸序列。本专利技术也涉及一种重组的核酸分子，其包含上述任何分离的核酸分子。在一些实 施方式中，所述重组核酸分子是载体。在一些实施方式中，所述分离的核酸分子操作性连接于编码蛋白质的多核苷酸序列。在一些实施方式中，所述蛋白质操作性连接于分泌信号。本专利技术也涉及一种宿主细胞，其包含上述任何分离的或重组的核酸分子或其组合。在一些实施方式中，宿主细胞是破囊壶菌目成员。在一些实施方式中，宿主细胞是为裂殖壶菌属(Schizochytrium)或破囊壶菌属(Thraustochytrium)。本专利技术也涉及一种产生蛋白质的方法，其包括在培养基中培养重组的破囊壶菌目微生物以产生所述蛋白质，其中所述重组微生物包含上述任何分离的核酸分子，所述核酸分子操作性连接于编码所述蛋白质的多核苷酸序列。在一些实施方式中，所述蛋白质从分离的破囊壶菌目生物质回收获得。在一些实施方式中，所述蛋白质在所述微生物内累积。在一些实施方式中，所述蛋白质在所述微生物的膜内累积。在一些实施方式中，所述蛋白质从培养基中回收获得。在一些实施方式中，所述蛋白质是分泌蛋白质。本专利技术也涉及一种分离的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO :1。本专利技术也涉及一种分离的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO :15。本专利技术也涉及一种转化宿主细胞的方法，其包括(a)用具有蛋白酶活性的酶预处理所述宿主细胞；和(b)通过电穿孔将核酸分子引入所述宿主细胞。附图简要说明图I为裂殖壶菌Na/Pi_IIIb2转运蛋白信号肽的氨基酸序列(SEQ ID NO :1)。图2为编码信号肽SEQ ID NO :I的多核苷酸序列(SEQ ID NO 2)。图3为裂殖壶菌PUFA PKS OrfC启动子区域的多核苷酸序列(SEQ ID NO 3)。图4为裂殖壶菌PUFA PKS OrfC终止子元件I的多核苷酸序列(SEQ ID NO 4)。图5为pSchizE的质粒图谱。图6为pSchiz-sG (又称pCOOOOl)的质粒图谱。图7为pSchiz-sGr的质粒图谱。图8为pSchiz-cG的质粒图谱。图9为eGFP在裂殖壶菌属细胞的胞质和内质网中的表达情况。图9A、9C和9已是荧光显微照片；图98、90和9F是可见光显微照片；图9么和9B是转化pSchiz-sGr后同一个视野下的细胞图；图9(和9D是转化pSchiz-cG后同一个视野下的细胞图；图9￡和9F是转化pSchiz-E后同一个视野下的细胞图。图IOA为pSchiz-sGr转化的裂殖壶菌细胞中，靶向内质网的eGFP和核酸染料4'，6_二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的荧光定位的复合图；图IOB和IOC分别为用于制备该复合显微图的eGFP-ER染色和DAPI-核染色图；图IOD为光镜下的同一视野；图IOA表明内质网膜包裹着各个细胞核，各细胞可包括多个细胞核。标示出一个细胞中只有一个核的相关特征。附图说明图11为从裂殖壶菌的4个转化克隆得到的无细胞上清液和无细胞提取物样品的蛋白质印迹和相应的考马斯蓝染色染色的SDS-PAGE凝胶。“sup”和“cyto”分别代表无细胞上清液和无细胞提取物；“sG”代表转化了 pSchiz-sGr质粒的细胞样品；“sGr”代表转化了 pSchiz-sGr质粒的细胞样品；“cG”代表转化了 pSchiz-cG质粒的细胞样品；“vec(_)”代表转化了 pSchiz-ElO质粒的细胞样品；“GFP (+) ”代表纯化的重组GFP标准品(加利福尼亚州山景城的克隆泰克公司(Clontech, Mountain View, CA)) ;SDS-PAGE胶上样量无细胞上清液蛋白质为3 u g，无细胞提取物蛋白质样品为I U g，在每对样品、重组GFP标准品和分子量标记物之间留有空白泳道。图12为裂殖壶菌Secl转运蛋白的前30个氨基酸，1-20位氨基酸为信号肽序列(SEQ I本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.03.16 US 61/160,618;2009.12.28 US 61/290,4411.一种分离的核酸分子,其包含多核苷酸序列SEQ ID NO :3。2.—种分离的核酸分子,其包含多核苷酸序列SEQ ID NO :4。3.一种分离的核酸分子，其包含编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO : I。4.根据权利要求3所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述多核苷酸序列包含SEQID NO :2。5.—种分离的核酸分子,其包含编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO :37。6.根据权利要求5所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述多核苷酸序列包含SEQID NO :38。7.一种分离的核酸分子，其包含多核苷酸序列SEQ ID NO 4208.根据权利要求7所述的分离的核酸分子，其包含多核苷酸序列SEQID NO 4309.一种分离的核酸分子,其包含多核苷酸序列SEQ ID NO :44。10.根据权利要求9所述的分离的核酸分子，其特征在于，其包含多核苷酸序列SEQIDNO :45。11.一种分离的核酸分子，其包含多核苷酸序列SEQ ID NO :46。12.—种分离的核酸分子,其包含与权利要求1-11中任一项所述的多核苷酸序列完全互补的多核苷酸序列。13.—种重组核酸分子，其包含权利要求1-12中任一项所述的分离的核酸分子或其组入口 o14.根据权利要求13所述的重组核酸分子，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·E·阿普特，J·C·利普迈耶，D·辛普森，J·王，J·P·怀恩，R·泽克尔，
申请(专利权)人：马太克生物科学公司，
类型：发明
国别省市：