半乳糖的测定方法与半乳糖诊断/测定试剂盒技术

本发明专利技术涉及利用酶比色法及酶联法技术的半乳糖含量的测定方法、试剂的组成及成分，其测定的技术原理是依据半乳糖激酶、氨甲酰磷酸合成酶、磷酸葡糖酸脱氢酶的系列催化反应完成，本发明专利技术还涉及一种半乳糖诊断/测定试剂盒。本发明专利技术的测定方法灵敏度高、误差小，因此本发明专利技术的测定方法与试剂盒可以广泛地应用于临床医学/食品检验。

【技术实现步骤摘要】
半乳糖的测定方法与半乳糖诊断/测定试剂盒
本专利技术涉及医学/食品检验测定
，更具体地，本专利技术涉及半乳糖诊断/测定方法及其试剂盒。
技术介绍
牛奶在营养界素有“液体黄金”的美称，我国早在1992年由七部位联合提出“一杯牛奶强壮一个民族”的口号。奶类除不含纤维素外，几乎含有人体所需要的各种营养素。 牛奶中的乳糖进入人体后，经小肠乳糖酶作用分解成葡萄糖和半乳糖。半乳糖是婴儿大脑发育的必需物质，与婴儿大脑的迅速成长有密切关系。牛奶虽好但并不是所有的人都能享受，有些人由于乳糖酶的缺乏，人体不能很好的消化吸收牛奶中的营养素，还会造成钙、磷、 钾、铁等元素的吸收障碍，影响婴幼儿的体格和智力发育，在老年人中，乳糖酶缺乏是造成骨质疏松的重要原因。中国成年人饮用牛乳后乳糖吸收不良的发病率高达86. 7 %，不耐受指数为0.9。为了避免不适当饮奶对健康造成的损害，因此最好在饮奶前检查自己是否耐受乳糖，在饮用牛奶后，测试尿液中半乳糖的浓度，这是目前国外最常用的一种方法，更为简便、 经济、可靠。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种半乳糖的测定方法。本专利技术的另一个目的是提供一种半乳糖诊断/测定试剂盒。本专利技术是通过下述技术方案实现的。本专利技术的方法是一种采用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)与酶 (偶)联法(Couple Reaction)的联用技术，利用测定还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在 340nm波长处的吸光度变化测定半乳糖的方法。本专利技术半乳糖测定方法的的技术原理是根据下述半乳糖激酶、氨甲酰磷酸合成酶、磷酸葡糖酸脱氢酶的系列催化反应完成 半乳糖+腺苷三磷酸半乳糖激酶腺苷二磷酸+半乳糖1-磷酸2腺苷二磷酸+磷酸根+谷氨酸+氨甲酰磷酸氨甲酰磷酸合成酶2腺苷三磷酸+谷氨酰胺+ 二氧化碳+水二氧化碳+核糖-5-磷酸+还原型辅酶磷酸葡糖酸脱氢酶磷酸葡糖酸+ 辅酶本专利技术的方法利用半乳糖激酶(galactokinase ;EC 2.7.1.6)酶(偶)联氨甲酰磷酸合成酶(arbamoyl-phosphate synthase ；EC 6. 3. 5. 5)、磷酸葡糖酸脱氢酶 (phosphogluconate dehydrogenase ；EC 1. 1. 1. 44)酶促反应终点法。半乳糖激酶酶解半乳糖反应产生腺苷二磷酸，再通过(偶)联合氨甲酰磷酸合成酶、磷酸葡糖酸脱氢酶的作用， 最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度，这样可以通过测量340nm处吸光度下降的程度，可以测算半乳糖的浓度大小。本专利技术是通过下述技术方案实现的。本专利技术涉及一种半乳糖的测定方法。该半乳糖测定方法的步骤如下A、样品准备A. 1标准样品的制备将一定量的半乳糖溶于水或缓冲液中，再将半乳糖浓度调整到100微摩尔/升，得到的溶液作为标准样品；A. 2待测样品的制备待测液体样品直接测试；将一定量的待测固体样品(如乳粉)像制备标准样品一样溶于水或缓冲液中；A. 3空白样品所述的水或缓冲液作为空白样品，其半乳糖浓度为0微摩尔/升；B、试剂溶液的制备分别移取或称取缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、半乳糖激酶、氨甲酰磷酸合成酶、磷酸葡糖酸脱氢酶、腺苷三磷酸、单价磷酸盐(磷酸根)、谷氨酸、氨甲酰磷酸与核糖-5-磷酸，然后将它们混合均勻，用水溶解得到所述的试剂溶液，它们的浓度分别是20-500mmol/ L、0. 001-7mol/L、0. 1-0. 35mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、 l-100mmol/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 与 l-lOOmmol/L ；C、待测样品与在步骤B)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/500进行混合，在温度15-45°C下反应5-60分钟，在主波长340nm与副波长405nm(如果受仪器限制可以不设副波长)下进行测定，测定其吸光度随时间的变化；D、在与步骤C)同样的条件下测定步骤A)标准样品的吸光度随时间的变化；E、在与步骤C)同样的条件下测定在步骤A)空白样品的吸光度随时间的变化；F、数据处理由步骤C-E)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到半乳糖的含量权利要求1.一种利用酶比色法及酶联法技术的半乳糖浓度测定方法，其测定的技术原理是根据下述半乳糖激酶、氨甲酰磷酸合成酶、磷酸葡糖酸脱氢酶的系列催化反应完成半乳糖+腺苷三磷酸半乳糖激酶腺苷二磷酸+半乳糖1-磷酸 2腺苷二磷酸+磷酸根+谷氨酸+氨甲酰磷酸氨甲酰磷酸合成酶 2腺苷三磷酸+谷氨酰胺+ 二氧化碳+水二氧化碳+核糖-5-磷酸+还原型辅酶磷酸葡糖酸脱氢酶磷酸葡糖酸+辅酶2.一种半乳糖的测定方法，其特征在于该方法的步骤如下 2. 1样品准备2. 1. 1标准样品的制备将一定量的半乳糖溶于水或缓冲液中，再将其浓度调整到100微摩尔/升； 2. 1.2待测样品的制备待测液体样品直接测试；将一定量的待测固体样品(如乳粉)像制备标准样品一样溶于水或缓冲液中； 2. 1.3空白样品所述的水或缓冲液作为空白样品，其半乳糖浓度为0微摩尔/升； 2. 2试剂溶液的制备分别移取或称取缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、半乳糖激酶、氨甲酰磷酸合成酶、磷酸葡糖酸脱氢酶、腺苷三磷酸、单价磷酸盐(磷酸根)、谷氨酸、氨甲酰磷酸与核糖-5-磷酸， 然后将它们混合均勻，用水溶解得到所述的试剂溶液，它们的浓度分别是20-500mmol/ L、0. 001-7mol/L、0. 1-0. 35mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、 l-100mmol/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 与 l-lOOmmol/L ；2. 3待测样品与在步骤2. 2)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/500进行混合，在温度15-45°C下反应5-60分钟，在主波长340nm与副波长405nm(如果受仪器限制，可以不设副波长)下进行测定，测定其吸光度随时间的变化；2. 4在与步骤2. 3)同样的条件下测定步骤2. 1. 1)标准样品的吸光度随时间的变化； 2. 5在与步骤2. 3)同样的条件下测定在步骤2. 1. 3)使用的水或缓冲液作为空白溶液的吸光度随时间的变化；2.6数据处理由步骤2. 3-2. 5)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到半乳糖的含量3.根据权利要求1、2所述的测定方法，其特征在于使用全自动生化分析仪测定时，待测样品、所述标准样品与所述空白样品由该分析仪在设定条件下自动取样，然后在下述条件下进行测定测定方法为终点法，温度37°C，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测半乳糖样品与试剂的体积比例为1/10-1/500，反应方向为负反应，延迟时间1/0分钟，检测时间4/5分钟。4.根据权利要求1、2或3所述的测定方法，其特征在于，所述的稳定剂是一种或多种选自硫酸铵、氯化钠、乙二醇、丙二醇、甘油或双乙酸钠、叠氮本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种利用酶比色法及酶联法技术的半乳糖浓度测定方法，其测定的技术原理是根据下述半乳糖激酶、氨甲酰磷酸合成酶、磷酸葡糖酸脱氢酶的系列催化反应完成：半乳糖＋腺苷三磷酸半乳糖激酶腺苷二磷酸＋半乳糖１－磷酸２腺苷二磷酸＋磷酸根＋谷氨酸＋氨甲酰磷酸氨甲酰磷酸合成酶２腺苷三磷酸＋谷氨酰胺＋二氧化碳＋水二氧化碳＋核糖－５－磷酸＋还原型辅酶磷酸葡糖酸脱氢酶磷酸葡糖酸＋辅酶

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32