一种可用于多个基因叠加顺式表达的载体，其特征是：含有两对同尾酶的限制性酶切位点序列，通过这两对同尾酶可以实现多个基因叠加在同一个载体中。所述载体的构建方法是通过PCR定点突变在启动子上游和终止子下游分别引入相应的限制性内切酶识别序列。在该表达载体中，每个基因都带有独立的启动子和终止子，构成独立的表达元件，再利用同尾酶实现独立表达元件的叠加组装，各基因的表达相对独立。该载体实现多个基因叠加非常方便快捷只需将目的基因分别克隆至表达载体的多克隆位点处，再利用两对同尾酶完成后续的组装。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化学
，涉及一种多个基因叠加顺式表达的酵母载体，本 专利技术还涉及该载体的构建方法，以及该载体在合成生物学中多个基因叠加顺式表达方面的 应用。
技术介绍
酵母菌是一种实验室最常用的遗传工程宿主菌，可用于表达真核生物外源基因。 常用的酵母表达载体pRS425,基因型为ori(f1) -lacZ-T7promoter_MCS(Kpnl-Sacl) _T3pr omoter-lacl-ori(pMBl) -ampR-〇ri(2micron) -LEU2,是大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒，其中 的pMBl复制起始位点和2micron复制起始位点分别控制载体在大肠杆菌和酵母菌中复制， 载体带有氨苄青霉素抗性基因和亮氨酸营养标志物，可用于筛选。 目前常见的酵母菌表达载体，包括上述的PRS425,基本上可以满足单个外源基因 在酵母菌中的常规表达，但是，很多生物学功能并不是由单一基因来控制和完成的，需要多 个相关基因共同作用，比如在合成生物学领域，经常需要顺式表达整套次生代谢产物合成 途径中的多个基因，才能实现其生物学功能，因此，实践中需要能够将多个基因叠加顺式表 达的酵母载体。 目前，尚未见构建多个基因叠加顺式表达酵母载体的报道。 此外，通过两对同尾酶实现的多个基因叠加在同一个载体上，也尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是构建一种多个基因叠加顺式表达的酵母载体，应用于多个基因叠 加顺式表达。 本专利技术构建了一种新型的多个基因叠加顺式表达酵母载体，达到了多个基因叠加 在同一个酵母表达载体上的目的。 目前，一般是通过多个质粒共转化系统实现多个基因叠加顺式表达策略，通常是 将多个外源基因分别克隆至不同筛选抗性或营养标志物的载体中，共同转化多个质粒后同 时添加多种抗生素，或者去除多种营养标志物，实现多个基因的顺式表达。由于受到抗性和 营养标记种类及组合方式的限制，这种方法仅能实现少数几个基因的顺式表达。而且，共同 转化的多个质粒如果使用相同的复制系统，即使用相同的复制起点，那这些质粒就属于不 相容质粒，当它们共转入同一细胞时，会在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争，导 致质粒丢失。如果使用的是不相同的复制系统，会导致复制拷贝数不同，影响后续实验效 率。 多个质粒共同转化系统存在诸多缺陷，所以实践中经常将多个基因叠加在一个载 体上然后进行单质粒转化。多个基因叠加在一个载体上也可以通过在多克隆位点处酶切连 接而实现，但是，多克隆位点处的限制性内切酶数量和种类有限，每增加一个基因，下一步 可利用的限制性内切酶数量和种类就会减少，因此，仅能实现少数几个基因叠加到载体上。 而且，在选择限制性内切酶种类时，还要考虑基因内部是否有这个限制性内切酶的序列，实 验设计非常麻烦，本专利技术涉及的一种多个基因叠加顺式表达的载体，能够非常方便快捷的 解决以上问题。 本专利技术的多个基因叠加顺式表达载体的特征是： 一种可用于多个基因叠加顺式表达的酵母表达载体，其特征为：含有两对同尾酶 的限制性内切酶酶切位点序列，通过这两对同尾酶可以实现多个基因叠加在同一个载体 上。 所述两对同尾酶可以选自以下同尾酶对中的两对：Xho I/Sal I、BamH I/Bgl II、 Xba I/Nhe I、Spe I/Nhe I或Xba I/Spe I等，也可以实现在同一载体中叠加多个基因的 目的。 所述表达载体选自酵母表达载体、pET系列的原核表达载体，或真核表达载体 pEGFP〇 所述酵母表达载体优选pRS425、pRS423、pRS426、pRS316 或pRS403 等。 根据实际需要选用载体基因表达盒相应的启动子和终止子，本专利技术的一个实施例 中，选取了乙醇脱氢酶ADH2的启动子ADH2p和终止子ADH2t，用于真菌多聚酮类次生代谢产 物的表达。在实践中，还可选取其它相应的启动子和终止子来完成相应的功能。 在本专利技术的一个实例中，通过对酵母表达载体pRS425进行定向改造，构建了一种 新型的多个基因叠加顺式表达的酵母载体，命名为PBDL6063。 本专利技术用以下实验证实了所述多个基因叠加顺式表达载体PBDL6063的功能： 选取了真菌多聚酮类化合物lasiodiplodin生物合成途径中的3个基因，分别为 还原型聚酮合酶LtLasSl，非还原型聚酮合酶LtLasS2,氧甲基转移酶LtOMT，将3个基因组 装至PBDL6063载体上，转化酵母异源表达得到了化合物lasiodiplodin(还包括不含甲基 基团的lasiodiplodin类似物），实现了 3个基因的共同顺式表达。本专利技术还将来源于真 菌多聚酮类化合物Hypothemycin生物合成途径中的氧甲基转移酶HsOMT与上述的3个基 因共同组装至PBDL6063载体中，转化酵母异源表达得到了 4种化合物，分别为甲基基团在 3位碳原子侧链羟基上的lasiodiplodin、不含甲基基团的lasiodiplodin类似物、甲基基 团在5位碳原子侧链羟基上的lasiodiplodin类似物、在3位和5位碳原子侧链羟基上都 含有甲基基团的lasiodiplodin类似物，实现了 4个基因的共同顺式表达。结果表明，构建 的载体是实用的，利用两对同尾酶在同一载体中叠加多个基因的策略是可行的。虽然本发 明人尚未进行数量大于4个基因的叠加顺式表达实验，但从理论上看，本领域技术人员可 以合理预测，该载体能够承载的基因数量及基因序列长度远在此4个基因之上。因为本载 体通过对两对同尾酶的酶切连接等操作来实现多个基因的叠加，实验过程中并不涉及到有 限的筛选抗性或营养标志物，所以本载体理论上可以叠加无限数量的基因，最多能够承载 多少基因有待在实际应用中得到进一步验证。 本专利技术的多个基因叠加顺式表达载体的构建方式，其特征是：在启动子上游和终 止子下游分别引入限制性内切酶识别序列。 具体方法是：首先在待改造的表达载体上加入启动子和终止子，再通过PCR定点 突变的方法分别在启动子上游和终止子下游引入限制性内切酶识别序列。 在本专利技术一个实例中是这样进行的：首先在酵母表达载体PRS425上加入乙醇脱 氢酶ADH2的启动子ADH2p和终止子ADH2t，再通过PCR定点突变的方法在启动子ADH2p上 游引入SalI内切酶识别序列，在终止子ADH2t下游引入BamHI和BglII两个内切酶识别 序列，最终得到改造成功的酵母表达载体PBDL6063。本专利技术构建的多个基因叠加顺式表达 载体PBDL6063可应用于合成生物学领域，表达整套次生代谢产物合成途径中的多个基因， 甚至整合不同合成途径中的多个基因，也可应用于蛋白复合物的表达与纯化等所有需要叠 加顺式表达多个基因的实验。 在所述多个基因叠加顺式表达载体中，每个基因都带有独立的启动子和终止子， 构成独立的表达元件，再利用同尾酶实现独立表达元件的叠加组装，各基因的表达相对独 立。利用XhoI/SalI和BamHI/BglII互为同尾酶的特点，实现单一质粒介导的多个基 因的高效顺式表达。载体中各个表达元件的叠加非常方便，只需将目的基因按照常规的方 法分别克隆至表达载体的多克隆位点处，再利用两对同尾酶完成后续的组装。当第二个基 因叠加组装至载体上时，相应的两对同尾酶位点本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可用于多个基因叠加顺式表达的载体，其特征是：含有两对同尾酶的限制性内切酶酶切位点序列，且通过这两对同尾酶可以实现多个基因叠加在同一个表达载体上；所用的表达载体源于酵母表达载体、pET系列的原核表达载体或真核表达载体pEGFP。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐玉泉，王晓婧，张维，刘航，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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