一种拓宽基因工程酶pH作用范围的方法。从GenBank中下载不同pH值作用范围的酶基因A及酶基因B，并进行优化设计，获得在酵母中表达的优化基因。将优化酶基因A的上游5’及下游3’端分别插入XbaI/NdeI/KasI/SnaBI等酶切位点，将酶基因B的上游5’及下游3’端分别插入NsiI/NspI/KpnI/NotI等酶切位点后，分别构建酶基因A、B的克隆载体pUCm-A和pUCm-B。经酶切及测序后构建了融合表达中间载体pPIC9KpP-B，再经酶切及测序后构建融合表达载体pPIC9KpP-AB。将重组质粒线性化后，电击转化酵母宿主细胞。经MD和MM平板筛选及酶活性测定，获得融合酵母阳性菌株。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种酶基因PH作用范围的技术，具体是专利技术了一种拓宽酶基因在酵母中PH作用范围的方法，将酶基因A的上游5’及下游3’端分别插入酶切位点，将酶基因B的上游5’及下游3’端分别插入酶切位点后，分别构建酶基因A、B的克隆载体pUCm-A和pUCm-B。经酶切及测序后构建了融合表达中间载体pPIC9K-B，再经酶切及测序后构建融合表达载体PPIC9K-AB。将重组质粒线性化后，电击转化酵母宿主细胞。经MD和MM平板筛选及酶活性测定，获得融合酵母阳性菌株。
技术介绍
酶作为一种生物催化剂，其在农业中的应用，主要作为催化剂或添加剂使用。在食品方面，主要起催化作用，用于农副产品的深加工。如利用α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶等对以淀粉为原料进行生产高果糖浆的工业。纤维素酶、木质素酶等用于纤维素农副产品等物质的分解与利用，保护环境，节约资源。酶工程在饲料工业中的应用已经颇为广泛。随着生活水平的日益提高，人们对绿色食品消费需求逐渐增加，对畜牧业生产与过程中的生态环境保护日益重视，饲用酶制剂以其高效、安全、低成本等特点，成为了世界新型饲料添加剂研究和应用热点。目前，酶被广泛用于饲料行业的生产，构建了各种基因工程菌并得到了高效表达，并进行了规模化的发酵生产，大大提高酶产量和降低了生产成本，已在饲料工业中被广泛应用。添加一点酶，就可以减少很多污染。然而，在饲料中，有的酶添加剂的酶催反应有效作用PH范围较低，在2.5-5.5之间，主要适用消化道呈酸性的单胃动物，而不适用于肠道呈中性的动物，不能在pH值接近中性的单胃动物肠道中表现酶活性。随着养殖业的发展,饲料使用量越来越大，产生的污染越来越多，因此，需要开发出PH作用范围广，热稳定性强的酶作为添加剂，用于饲料生产，从而减少污染。现在，随着酶基因工程技术性问题的不断突破，因其先进的技术，低耗能，高效率等特点，还被广泛用于医药卫生、食品加工、能源开发以及环境工程等方面。而对于医药工业、能源开发及环境工程等方面，需要的酶的作用条件更为广泛和特别。因此，可以通过对酶基因进行改造，使其在酵母或者大肠杆菌等受体细胞中表达，从而拓宽酶的作用范围及稳定性等特性，从而使基因工程菌在同等条件下工作效率更高，节约资源和成本。此外，酶工程还广泛用于食品添加剂生产，不断开发新酶源，研制新产品，可以降低生产成本，产品易纯化，收率提高。如酶工程在甜味剂、调味剂、抗氧化剂中的应用。采用低浓度的乙醇、氨基酸和溶菌酶复酶添加入食品的杀菌防腐的方法越来越受到人们的重视，并在食品加工业中广泛推广。随着近年来酒精需求量的上升，固定化细胞技术应用于酒精工业生产方面的研究也变得非常活跃。
技术实现思路
本专利技术主要解决的问题是拓宽酶作用pH范围，提高酶热稳定，实现改造酶基因在酵母或大肠杆菌等受体细胞中的高效表达，改变酶基因的某些特性，整体上提高酶基因的PH作用范围等问题。获得高效表达酶基因工程菌，从而解决不同产业中的各种问题。本专利技术主要通过以下方法步骤实现: (I)从Genbank中下载酶编码基因序列，获得具有不同pH作用范围的目的酶基因A和酶基因B。(2)利用分子生物学软件Lasergene分别分析酶基因A和酶基因B的碱基含量、密码子分布情况、AT组成及GC含量等，并分析酶基因A和酶基因B的密码子在酵母中合适度，选用酵母高频密码子，减少基因中低频密码子，优化设计酶基因A和酶基因B。(3)得到优化酶基因A和酶基因B，并合成基因，在合成基因上游5’端加入油al/Ndel/Kasl/SnaBl等酶切位点，下游3’端加入等酶切位点，以便基因转入表达载体获得优化基因重组表达载体/?°- k，pP- B。(4)根据优化基因A、B，设计酶基因A、B基因胞外表达片段的PCR引物2对，在优化基因A上游5’端引入酶切位点，在下游5’端引入酶切位点；在优化基因B上游5’端引入酶切位点及接头(G4S)3，在下游5’端引入酶切位点。(5)用质粒提取试剂盒，对含有重组质粒的大肠杆菌中提取含有酶基因A、酶基因B的重组质粒pUCm-A、pUCm-B。然后用酶将pUCm-A、pUCm-B进行双酶切，以相应的PCR产物作对照，电泳检测。用胶回收试剂盒回收与PCR产物一样大小的片段，回收产物于一 20°C保存备用。(6 )将PUCm-B质粒DNA进行双酶切，以相应PCR产物作对照，电泳检测。从凝胶上回收与PCR产物一样大小的片段，用胶回收试剂盒进行纯化，回收产物于一 20°C保存备用。(7)将从大肠杆菌中提取含酶基因B的pPIC9K载体质粒DNA进行双酶切，并分别以双酶切的酶进行单酶切以及未酶切的质粒作对照，构建PP-B。点样电泳检查是否酶切完全。将酶切完全的载体质粒用0.8%琼脂糖凝胶电泳、回收、纯化，回收产物于一 20°C保存备用。(8)依照上一步，将A基因连接入pP-B，构建pP-AB融合基因表达载体。(9)用质粒提取试剂盒,从大肠杆菌中提取pPIC9k_AB重组表达载体质粒,制备酵母感受态细胞，经内切酶线性化重组表达载体质粒/^-AB后，电转化酵母宿主细胞，经MD/MM平板筛选，PCR检测后，获得阳性重组酵母。实现优化酶基因B在酵母中的分泌表达。后经甲醇诱导摇瓶发酵，测定酶活性。具体应用实例: Genbank中获取的酶基因A(最适作用pH 5.5)、酶基因B(最适作用pH7.0),根据酵母密码子偏爱性分别设计优化基因后，将优化酶基因B成功插入pPIC9K表达载体中，经酶切、测序后，优化酶基因A成功插入了 PPIC9K3中间表达载体中，基因融合表达载pPIC9KjS构建成功。经内切酶线性化融合载体pPIC9US电击转化酵母宿主细胞后，获得阳性重组酵母。经甲醇诱导摇瓶发酵后，发现重组酵母的酶活性在PH为5.5,7.0,9.0时都表现了最高活性。由此可见，将酶基因A和酶基因B进行融合后，可以拓宽酶基因在酵母中的pH作用范围，提高酶活性。该法可用于其他酶基因的融合表达，从而拓宽酶基因的PH作用范围，提高酶活，降低生产成本。【主权项】1.，该方法主要包括筛选不同pH作用范围值的酶基因，酶基因的优化设计确定，酶基因克隆载体、融合表达中间载体的构建，以及融合表达载体在酵母中的电击转化，酵母阳性菌株的筛选，酶活性检测。2.根据权利要求1所述的一种拓宽基因工程酶PH作用范围的方法，其特征在于:该融合载体能在酵母中分泌表达，且其PH作用范围明显拓宽，热稳定性增强，酶活性增强。【专利摘要】。从GenBank中下载不同pH值作用范围的酶基因A及酶基因B，并进行优化设计，获得在酵母中表达的优化基因。将优化酶基因A的上游5’及下游3’端分别插入XbaI/NdeI/KasI/SnaBI等酶切位点，将酶基因B的上游5’及下游3’端分别插入NsiI/NspI/KpnI/NotI等酶切位点后，分别构建酶基因A、B的克隆载体pUCm-A和pUCm-B。经酶切及测序后构建了融合表达中间载体pPIC9KpP-B，再经酶切及测序后构建融合表达载体pPIC9KpP-AB。将重组质粒线性化后，电击转化酵母宿主细胞。经MD和MM平板筛选及酶活性测定，获得融合酵母阳性菌株。【IPC分类】C12N15-81, C12N1-19【公开号】CN104774864【申请号】CN201本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种拓宽基因工程酶pH作用范围的方法，该方法主要包括筛选不同pH作用范围值的酶基因，酶基因的优化设计确定，酶基因克隆载体、融合表达中间载体的构建，以及融合表达载体在酵母中的电击转化，酵母阳性菌株的筛选，酶活性检测。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邹立扣，龙梅，王红宁，陈惠，吴琦，李蓓，吴国艳，郭莉娟，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51
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