本发明专利技术涉及一种新型抗凝剂白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白ALP的表达制备方法，步骤如下：(1)优化合成ALP成熟肽DNA；(2)重组质粒pPICZαA-ALP的构建；(3)重组蛋白ALP的表达和纯化。本发明专利技术方法利用pPICZαA载体的毕赤酵母表达系统(pPICZαA-ALP X33)表达的ALP蛋白能够正确分泌表达，经纯化后具有抗凝血活性，在体外能够显著延长凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)，可作为一种新型抗凝剂使用，为进一步研究其作为预防和治疗血栓栓塞性等血管性疾病的新型抗凝剂的可行性奠定了研究基础，因此，本发明专利技术方法如果被广泛证明并运用于临床将具备积极的社会效益和可观的经济效益。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学
，涉及ALP基因的优化合成、重组表达质粒 pPICZaA-ALP的构建、重组表达菌株pPICZaA-ALPX33的构建、目的蛋白ALP的诱导 表达及纯化、ALP蛋白在体外抗凝血中的应用，尤其是一种新型抗凝剂白纹伊蚊唾液腺 aegyptin相似蛋白ALP的表达制备方法和应用。
技术介绍
ALP蛋白即白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白（Aedesalbopictus aegyptin-likeprotein，alALP)，以下简称ALP。 1、血栓栓塞性疾病等血管性疾病的治疗与预防需要新型的抗凝剂抗凝药物被广泛用于血栓栓塞性疾病的预防和治疗，如脑卒中、房颤（AF)、急性冠 脉综合征（ACS)、弥散性血管内凝血、肺栓塞（PE)、外科手术后静脉血栓栓塞症（VTE)等。 这些疾病均需用抗凝药物来防治血栓栓塞形成和/或复发。目前常用的抗凝剂包括肝素 (UFH)、低分子肝素（LMWH)和华法林（warfarin)，它们预防和治疗血栓栓塞性疾病的效果 已被众多的临床试验所证明且广泛用于临床实践。然而，这些药物或多或少具有明显的缺 点：如药效学或药动学存在不可预测性，容易导致出血；需要实验室监测以调整剂量（如肝 素、华法林）；肝素诱导血小板减少症及骨质疏松症；非胃肠道给药（如肝素、低分子肝素） 等。这些缺点限制了上述药物的临床应用，因此研发新的抗凝药物，既能更有效抗凝，又能 克服现有药物的缺点一直是该领域的重点和难点。近年来随着对凝血的潜在分子机制的更 多了解、重组DNA技术的进步、药物化学合成技术的提高等，已经加速了抗凝新药的研宄步 伐。 因此，血栓栓塞性疾病等血管性疾病的治疗与预防仍需要不断研发有效安全的新 型抗凝剂。2、蚊唾液腺某些功能蛋白具有抗凝血的作用 蚊为重要的吸血昆虫，已有研宄表明其唾液具有重要的生物学活性，尤其对脊椎 动物宿主具有抗凝血、抗炎和调节宿主免疫功能的作用。脊椎动物凝血系统是一个高度复 杂、精细、高效的体系，当蚊叮咬时，宿主立即启动凝血过程，主要包括3种方式：缩血管反 应、血小板凝集和血液级联凝集形成血凝块。这几种方式相互协同，防止组织破损处进一步 失血。研宄发现，为了克服这些障碍，蚊吸血时其唾液腺分泌一组抗凝血活性物质，这些物 质可干扰宿主的凝血反应和炎症反应以促进吸血的完成，更是一组具有潜在药理活性的物 质，它将为新型心血管疾病治疗药物的研发提供依据，进而为制备安全可靠的抗凝药物提 供可能。3、白纹伊蚊唾液腺蛋白alALP有开发成新型抗凝剂的潜力 Aegyptin是埃及伊蚊雌蚊唾液腺特异性分泌蛋白，属于30KDa的唾液腺变应原家 族，它是一种新发现的抗凝剂。该蛋白能特异性识别血小板糖蛋白VI因子、整合素a 和血管性假血友病因子（vWf)的特定位置，从而阻止胶原蛋白和这三种主要配体的作用。Calvo等进一步研宄了Aegyptin的作用机制，他们通过表面等离子体共振技术鉴定了血管 性假血友病因子与胶原蛋白结合位点的氨基酸序列：RGQOGVMGF(其中0代表羟脯氨酸），该 序列作为胶原蛋白的高亲和位点介导胶原蛋白与血管性假血友病因子（vWF)的相互作用。 另外，Aegyptin能与线性多肽RGQPGVMGF和热变性胶原蛋白发生相互作用。但是，Aegyptin 与不规则的RGQPGVMGF多肽不发生作用。Aegyptin也能识别多肽（GP0)和GF0GER，并具 有较弱的亲和力，他们分别是糖蛋白VI和整合素在胶原蛋白上的绑定部位。在 Aegyptin的解离短肽中，它的羧基端片段具有和胶原蛋白结合的能力，还能减弱血小板的 聚集。此外，在活体中有玫瑰红存在的情况下，Aegyptin阻止了激光诱导的小鼠颈动脉血 栓的形成。这些结果说明，Aegytpin能与胶原蛋白上的特定部位结合，抑制血小板和胶原 蛋白在体内和体外的相互作用，是一种研宄血栓特点和分子形成机制的分子工具。Area等完成了白纹伊蚊唾液腺转录组和蛋白质组的分析，其中报道了另一种 30000Mr的唾液腺变应原家族蛋白的cDNA和蛋白序列（gi:56417504)。本申请人前期对该 蛋白和aegyptin蛋白序列进行生物信息学分析发现它们具有很高的同源性，并命名为白 纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白（Aedesalbopictusaegyptin-likeprotein，alALP)〇 生物信息分析结果显示，它们的保守氨基酸C(半胱氨酸）和P(脯氨酸）的数量和位置都 是一致的，较保守氨基酸G(甘氨酸）的数量和位置也几乎一致，其羧基端最末的35个氨基 酸高度保守，只有3个氨基酸不同。同时，用singalP4.0预测到它们的信号肽剪切位点是 相同的。因此，认为这两种蛋白可能具有相似的功能。 同时，现有研宄报道只认为ALP蛋白是蚊叮咬时引起人免疫反应的免疫原之一， 而且，现有的ALP原核表达系统存在无法表达，或者表达的ALP蛋白融合有分子量与ALP自 身相当的GST标签，同时原核表达无法将ALP进行分泌表达，意味着原先在蚊唾液腺中进行 分泌表达的ALP蛋白在原核中表达时其无法进行正确的加工、折叠和翻译后修饰。这些因 素都影响了ALP蛋白的生物学活性，特别是原核表达的ALP蛋白不具备抗凝血活性。 另外，现有的毕赤酵母表达系统尚未见对ALP蛋白的表达。 通过检索，与本专利技术专利申请接近的现有技术有如下两种： 1、ALP蛋白的原核表达技术： ALP蛋白最先由赵郭存等报道它是一种蚊唾液腺的主要免疫原蛋白并尝试将 其克隆转入pET_28a原核载体中表达，但并没有报道其表达的结果。本申请人成功利用 PGEX-6P-1原核表达载体表达并纯化到了ALP重组融合蛋白，经分析发现该蛋白具有较强 的免疫原性和免疫反应性。 2、利用pPICZaA载体的毕赤酵母表达技术： 主要是Invitrogen公司的pPICZ系列载体表达说明手册《EasySelect?Pichia ExpressionKit》（Cat.no.K1740-01)，pPICZaA特别适合表达分泌型蛋白，同时具备酵母 表达的基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加 工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒 或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母， 毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的 十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 3、《按毕赤酵母偏爱密码子优化的木聚糖酶cxyll基因及其表达》，专利【申请号】 200910200673. 0,该专利技术涉及一种按毕赤酵母偏爱密码子优化的木聚糖酶cxyll基因及其 表达，所述优化的木聚糖酶cxyl1基因采用连续延伸PCR方法合成，所述基因全长489bp，编 码162个氨基酸，通过将该基因序列构建到毕赤酵母表达载体并转化入毕赤酵母中表达， 可用于木聚糖酶的生产。 通过对比，本专利技术专利申请与上述相关的公开文献存在本质的不同。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服原有技术的不足之处，提供一种新型抗凝剂白纹伊蚊唾液 腺aegyptin相似蛋白本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种新型抗凝剂白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白ALP的表达制备方法，其特征在于：步骤如下：⑴优化合成ALP成熟肽DNA按毕赤酵母密码子偏好性优化合成，优化合成的ALP成熟肽基因序列为：序列1；序列2、序列3分别为EcoR I、Xba I的酶切位点；⑵重组质粒pPICZαA‑ALP的构建①双酶切优化合成的ALP成熟肽DNA和质粒pPICZαA经EcoR I和Xba I双酶切，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收酶切产物，酶切后得目的基因ALP；优化合成的ALP成熟肽DNA的酶切体系和条件如下：补充ddH2O至20μl体系，22‑37℃水浴反应5min‑4h，60‑80℃灭活5‑10min；质粒pPICZαA的酶切体系同以上体系，反应条件相同，得酶切后pPICZαA质粒；酶切产物经l％琼脂糖凝胶电泳鉴定，琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化目的片段，得目的基因ALP；②连接目的基因ALP与酶切后质粒pPICZαA按10：1摩尔比混合于反应体系中，16‑25℃水浴连接5min‑4h，得连接产物；20μl的反应体系如下：③转化和阳性克隆的鉴定于冰上，取连接产物2μl加入100μl E.coli DH5α感受态细胞中，冰浴30min后，42℃热激转化90sec，冰浴1‑3min，加入LB液体培养基700μl；37℃振荡培养1‑2h，取菌液涂于含博来霉素50‑150μg/ml的LB低盐平板上；37℃过夜培养，挑取阳性克隆接种于含博来霉素50‑150μg/ml的LB低盐培养液中；37℃振荡培养10‑16h，提取质粒，用EcoR I和XbaI进行双酶切鉴定，结果经1％琼脂糖凝胶电泳分析；④线性化取PCR和双酶切均鉴定为阳性克隆的菌液，用含博来霉素50‑150μg/ml的LB低盐培养液扩大培养后，提取全部质粒；取纯化的单拷贝质粒，用SacI完全酶切，琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化DNA片段，溶解于10‑30μl的无菌去离子水，得线性化的单拷贝质粒；SacI线性化酶切体系如下：10×FastDigest buffer 5μl；纯化的单拷贝质粒 8‑10μg；SacI 2‑6μl；补充ddH2O至50μl体系，22‑37℃水浴反应1‑4h，60‑80℃灭活5‑10min；⑤毕赤酵母X‑33感受态细胞的制备挑取YPD平板上X‑33菌株接种接入20ml YPD培养基，29℃，250rpm培养至OD600＝1.3‑1.5，4℃，1500g，离心5min沉淀细胞，用10ml冰浴的无菌去离子水重新悬浮细胞；4℃，1500g，离心5min沉淀细胞，用5ml冰冷的无菌去离子水悬浮重新悬浮细胞；4℃，1500g，离心5min沉淀细胞，用2ml冰冷的无菌1M山梨醇悬浮重新悬浮细胞；4℃，1500g，离心5min沉淀细胞，用200ul冰冷的无菌1M山梨醇悬浮，得X‑33感受态细胞；⑥电转化按线性化的单拷贝质粒：X‑33感受态细胞的体积比为1：8的比例，分别取线性化的单拷贝质粒加入X‑33感受态细胞并轻轻混匀，转入预冷电转杯，冰上放置5min，放入电转仪，电击转化，电压：1500V，电击时间：分别为5.4ms 5.6ms，电击完成后，立即加入1ml、1M冰浴的山梨醇，混匀后转移到离心管中，28‑30℃，静止1h，涂含博来霉素50‑150μg/ml的YPDS平板；28‑30℃，培养2‑4d，得转化子；⑦提取酵母基因组挑取转化子于含100ug/ml博来霉素的YPD液体培养基中，30度，220rpm/min过夜培养，次日提取转化子酵母基因组；⑧pPICZαA‑ALPX33阳性菌株的PCR鉴定提取的酵母基因组利用通用引物5’AOX1和3’AOX1进行PCR鉴定，引物序列如下：5’AOX1：序列4；3’AOX1：序列5；PCR反应体系为：条件为：PCR参数：55℃退火30s，25‑30个循环；PCR反应体系为：PCR反应条件为：共设定25‑30个循环，最后于72℃条件下延伸5‑10min。PCR产物经l％琼脂糖凝胶电泳鉴定，得阳性克隆子；⑶重组蛋白ALP的表达和纯化①诱导表达和优化条件划线阳性克隆子于YPD平板，2天后挑取单菌落接种于BMGY培养基中，生长40h‑48h，4℃8000rpm离心5‑10min，将沉淀换至含体积分数0.5‑1.0％甲醇的培养基BMMY，28‑30℃，220‑250rpm/min诱导表达；②大量表达和纯化甲醇诱导24‑72h后，全部取样，经冻干20倍浓缩，过滤，按照Ni‑NTAAgarose试剂盒说明书纯化目的蛋白，然后将目的蛋白经1％(质量百分数)PBS、pH＝7.0透析过夜，超滤器浓缩于Tris‑HCl缓冲液pH 8.0中，‑20℃冻存，即得白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白ALP。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：梁韶晖，李星潘，刘文权，张亮亮，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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