通过在酿酒酵母中的表达产生可分泌抗体的方法技术

本发明专利技术涉及用于在酿酒酵母细胞的表面上产生和非共价表面呈递抗体和衍生片段以及基于其的分子文库的方法。表面呈递的非共价方式使得可能借助高通量筛选选择特定变体和随后所选结合分子可切换分泌至培养上清液用于生化表征。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利技术主题本专利技术涉及用于在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞的表面上产生和非共价表面呈递抗体和衍生片段以及基于其的分子文库的方法。表面呈递的非共价方式使得可能借助高通量筛选选择特定变体和随后所选结合分子可切换分泌至培养上清液用于生化表征。本专利技术还涉及用于在酵母细胞的表面上呈递抗体或抗体文库和筛选这些文库的具有特别期望特性的免疫球蛋白的方法。专利技术背景单克隆抗体的发现已经从杂交瘤技术进化，在其帮助下，可以以特异性方式产生具有特定特异性和亲和力的抗体。由其开发的组合文库，包括筛选和选择方法，已经发展成标准工具，用于通常修饰蛋白的结合特性。用于生成和筛选抗体文库的最普遍的技术曾经是“噬菌体呈递”方法，并且在一些情况下仍然是“噬菌体呈递”方法，其中特定目标蛋白可以在噬菌体外壳蛋白上表达为融合多肽，并且通过结合至固定或可溶性生物素化的配体而选择。已经以这种方式构建的噬菌体可被视为紧凑遗传单元，其已经在表型和基因型特性两者方面自身组合。抗体、抗体片段、酶、DNA结合蛋白等上已经非常成功地使用噬菌体呈递。通过在称为“淘选”的过程中结合至固定抗原选择具有期望结合特性的抗体。洗出含有非特异性抗体的噬菌体，将结合的噬菌体分离且在大肠杆菌中扩增。该设置已用于生成大量抗原特异性抗体。尽管如此，噬菌体呈递技术具有一些基本缺陷和困难，其限制了其用途，特别是在真核蛋白的产生中。因此，例如，可以分离非常高亲和力的抗体，并且仅困难地通过“淘选” 进一步处理。此外，可以影响抗体的特异性和亲和力的翻译后修饰，诸如例如糖基化，用噬菌体呈递方法是不可能的。一种替代方案是使用低等真核系统，诸如酵母。与在丝状噬菌体的情况下相比，B细胞呈递抗体和酵母细胞呈递抗体之间的结构相似性使得更接近类似于体内“亲和力成熟”。因为具体地真核细胞诸如酵母能够产生糖基化蛋白，而丝状噬菌体不能做到这一点，来自真核宿主细胞的单克隆抗体应当具有比来自噬菌体的抗体更类似于人或哺乳动物的特性。此外，在酵母中克隆、表达和修饰抗体特别已经证明在方法和实用性方面是有效和简单的。US 6,699,658描述了，例如，酵母细胞表面呈递方法，在其帮助下，组合抗体文库的筛选和生产已经变得可能。所述“酵母表面呈递”技术基于用表达融合至酵母细胞壁蛋白的免疫球蛋白的载体转染酵母细胞，采用诱变以便生成免疫球蛋白变体的多样性且以便然后根据期望表型特性选择这些细胞。该技术由Boder和Wittrup在1997年建立。他们首次成功地在酵母细胞的表面上功能呈递组合文库的scFv片段，通过流式细胞术筛选它们，并且分离对于抗原具有增加亲和力的scFv片段。基因型和表型的稳定偶联使其变得可能，因为scFv片段被呈递为具有酵母固有的细胞壁蛋白的融合蛋白。据推测，通过使用基于酵母的呈递技术实现的最重要成就是荧光激活的细胞分选(FACS)的直接适用性，这在有效筛选大变体文库中是决定性的。稳定的基因型 - 表型偶联通过异源蛋白与酿酒酵母的外细胞壁的蛋白的融合来实现。由此实现的蛋白暴露是与抗原相互作用的前提条件。然而，如Wittrup和Boder开发的刚刚描述的酵母表面呈递特别具有一些实际缺点。一个缺点是，例如，各种表达的蛋白无法获得，或者只能用相同的酵母细胞不令人满意地获得。此外，通过Wittrup的方法，期望的免疫球蛋白共价结合至细胞壁蛋白，并且必须通过另外的方法步骤进行分离。WO 2010/005863描述了基于巴斯德毕赤酵母种的酵母细胞的相应酵母表面呈递系统，其中免疫球蛋白非共价地结合至蛋白A的ZZ结构域，其中当用于表达所述蛋白的相应多种启动子以正确的时间顺序开启或关闭时，包含细胞壁蛋白凝集素或其亚单位和ZZ结构域和免疫球蛋白的融合蛋白仅在酵母细胞中同时表达且分泌，以便被呈递在细胞表面上。专利技术概述本专利技术涉及开发用于在酵母种酿酒酵母细胞的表面上非共价表面呈递抗体和衍生片段以及基于其的分子文库的方法。表面呈递的非共价方式意欲使得可能借助高通量筛选选择特定变体和随后所选结合分子可切换分泌至培养上清液用于生化表征。焦点是选择和生产的成功组合，其节约时间地省略亚克隆和重新格式化步骤，诸如在已知相当方法中必需的步骤，诸如例如噬菌体上的蛋白表面呈递。该组合导致抗体的活性成分发现中的后续过程的简化和加速。通过本身已知的使用Fc结合结构域、优选来自金黄色葡萄球菌蛋白A的ZZ结构域作为表面呈递的介体，可以在酵母细胞上成功地呈递抗体、生物活性抗体片段和抗体结构域，诸如，例如，VHH-Fc融合蛋白(由两条蛋白链组成)。令人惊讶地，通过使用酵母酿酒酵母作为宿主生物体，在表面呈递过程中已经选择蛋白的正确折叠、分泌和稳定性，因为作为真核生物，该酵母在蛋白合成过程中具有质量控制的机制。通过此处呈现的方法，可以在酵母细胞的表面上以对其用途特异性的最终形式呈递VHH-Fc融合蛋白和更复杂的蛋白，诸如整个抗体，并且以这种方式，能够使用蛋白工程改造的方法。其后，所选克隆可以直接用于产生蛋白。因此，本专利技术提供用于通过表达、分泌和将其呈递在酵母细胞的表面上而产生多种IgG分子，诸如抗体、生物活性抗体片段或具有特定特性的抗体结构域的方法，其中根据本专利技术的方法包括以下步骤：(a) 提供酵母种酿酒酵母的宿主细胞，其已经用合适质粒的形式的第一和第二核酸分子转染，其中所述第一核酸分子编码融合蛋白，所述融合蛋白基本上包含细胞表面锚定蛋白、Fc结合结构域和可调节启动子，所述可调节启动子根据培养条件控制所述融合蛋白的表达，并且所述第二核酸分子编码所述抗体群体，所述抗体片段或抗体结构域呈其轻链和重链的形式，并且在永久活性启动子的控制下，(b) 通过在培养基中存在具有> 5,000的分子量的聚乙二醇(PEG)的情况下在酵母细胞中同时共表达多种抗体、抗体片段或抗体结构域而表达所述融合蛋白，其中所述IgG分子以及融合蛋白以可溶性形式从酵母细胞分泌，(c) 在所述酵母细胞的表面上呈递多种抗体、抗体片段或抗体结构域，其以非共价形式结合至表达的锚定至细胞表面的融合蛋白的Fc结合结构域，(d) 根据结合至Fc结合结构域的多种抗体、生物活性抗体片段或抗体结构域的期望的不同的表型或结合特性，在结合至融合蛋白或Ig分子或其中含有的检测标记的帮助下选择和分离酵母细胞，(e) 在不允许或基本不允许进一步表达融合蛋白的培养条件下在特定选择的酵母细胞群体中表达多种抗体、生物活性抗体片段或抗体结构域，和(f) 从培养基分离具有所选表型或结合特性的多种抗体。与此相反，在根据WO 2010/0058863的方法中，在巴斯德毕赤酵母中表达本身相同的融合蛋白和免疫球蛋白不同时进行：反而，该系统只有当通过活化负责的启动子诱导和操作细胞表面“捕获”分子的表达才在一定程度上有效地发挥作用，而没有同时发生免疫球蛋白的轻链和重链的值得注意的表达。在捕获分子的表达已经由于经由可调控启动子抑制而停止之后，这仅在第二步骤中实现。令人惊讶地，这在根据本专利技术的方法中是不必要的。尽管初始活化Fc结合结构域的启动子，Ig分子的表达已经可以同时本文档来自技高网...

【技术保护点】
通过表达、分泌和将其呈递在酵母细胞的表面上而产生多种抗体、生物活性抗体片段或具有特定特性的抗体结构域的方法，其包括以下步骤：(a) 提供酵母种酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的宿主细胞，其已经用合适质粒的形式的第一和第二核酸分子转染，其中所述第一核酸分子编码融合蛋白，所述融合蛋白基本上包含细胞表面锚定蛋白、Fc结合结构域和可调节启动子，所述可调节启动子根据培养条件控制所述融合蛋白的表达，并且所述第二核酸分子编码所述抗体群体，所述抗体片段或抗体结构域呈其轻链和重链的形式，并且在永久活性启动子的控制下， (b) 通过在培养基中存在具有> 5,000的分子量的聚乙二醇(PEG)的情况下在酵母细胞中同时共表达多种抗体、抗体片段或抗体结构域而表达所述融合蛋白，其中所述免疫球蛋白分子以及融合蛋白以可溶性形式从酵母细胞分泌，(c) 在所述酵母细胞的表面上呈递多种抗体、抗体片段或抗体结构域，其以非共价形式结合至表达的锚定至细胞表面的融合蛋白的Fc结合结构域，(d) 根据结合至Fc结合结构域的多种抗体、生物活性抗体片段或抗体结构域的期望的不同的表型或结合特性，在结合至融合蛋白或免疫球蛋白分子或其中含有的检测标记的帮助下选择和分离酵母细胞，(e) 在使得可能不或基本不进一步表达融合蛋白的培养条件下在特定选择的酵母细胞群体中表达多种抗体、生物活性抗体片段或抗体结构域，和(f) 从培养基分离具有所选表型或结合特性的多种抗体。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.01.03 EP 13000016.91.通过表达、分泌和将其呈递在酵母细胞的表面上而产生多种抗体、生物活性抗体片段或具有特定特性的抗体结构域的方法，其包括以下步骤：
(a) 提供酵母种酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的宿主细胞，其已经用合适质粒的形式的第一和第二核酸分子转染，其中所述第一核酸分子编码融合蛋白，所述融合蛋白基本上包含细胞表面锚定蛋白、Fc结合结构域和可调节启动子，所述可调节启动子根据培养条件控制所述融合蛋白的表达，并且所述第二核酸分子编码所述抗体群体，所述抗体片段或抗体结构域呈其轻链和重链的形式，并且在永久活性启动子的控制下， 
(b) 通过在培养基中存在具有> 5,000的分子量的聚乙二醇(PEG)的情况下在酵母细胞中同时共表达多种抗体、抗体片段或抗体结构域而表达所述融合蛋白，其中所述免疫球蛋白分子以及融合蛋白以可溶性形式从酵母细胞分泌，
(c) 在所述酵母细胞的表面上呈递多种抗体、抗体片段或抗体结构域，其以非共价形式结合至表达的锚定至细胞表面的融合蛋白的Fc结合结构域，
(d) 根据结合至Fc结合结构域的多种抗体、生物活性抗体片段或抗体结构域的期望的不同的表型或结合特性，在结合至融合蛋白或免疫球蛋白分子或其中含有的检测标记的帮助下选择和分离酵母细胞，
(e) 在使得可能不或基本不进一步表达融合蛋白的培养条件下在特定选择的酵母细胞群体中表达多种抗体、生物活性抗体片段或抗体结...

【专利技术属性】
技术研发人员：R京特，B霍克，S贝克，L里尔，
申请(专利权)人：默克专利股份公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE