本发明专利技术公开了一种分泌抗马铃薯S病毒(PVS)单抗杂交瘤细胞株及其单抗的应用。利用差速离心法提纯的PVS病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗PVS单抗的杂交瘤细胞株16C10，其保藏号为CGMCC No.12002。该细胞株分泌单抗腹水间接ELISA效价达10-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，该单抗与34kDa的PVS外壳蛋白亚基有特异反应。利用16C10单抗建立检测马铃薯植株中PVS的ACP-ELISA、dot-ELISA和Tissue blot-ELISA检测方法，其中ACP-ELISA和dot-ELISA方法检测病叶的灵敏度分别达到1:81920和1:10240倍稀释(w/v,g/mL)。抗PVS单抗的制备及其检测方法的建立为该马铃薯病毒病的诊断和检测、流行病学分析及科学防控提供物质和技术支撑。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种分泌抗马铃薯S病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。
技术介绍
马铃薯S病毒(PotatovirusS,PVS)也称作马铃薯潜隐病毒，是危害马铃薯的主要病毒之一，该病毒属于乙型线型病毒科(Betaflexiviridae)麝香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)的成员。PVS在1948年首次报道于荷兰，随后在世界各马铃薯种植地区皆有报道，且其分布十分广泛。目前在我国北方的内蒙古、黑龙江、辽宁、河北、山东、青海以及南方的广西、湖南、四川、浙江、福建、贵州等地均被发现，为给马铃薯的生产造成了严重的损失。PVS在大多数马铃薯品种上可引起叶脉颜色变深、叶片粗缩、叶尖下卷、叶色变浅；有的马铃薯品种感病后产生轻度斑驳、脉带；有的品种感病后期变成青铜色，严重皱缩，叶面产生小的坏死斑，甚至落叶。研究发现该病毒可以通过汁液接触和蚜虫介体传播到茄科和藜科植物上，且该病毒常常与其他病毒复合侵染马铃薯造成更为严重的危害。PVS的基因组全长8.4-8.5kb，包含六个开放阅读框(ORF)，其中ORF5编码一个34kDa的外壳蛋白(CP)。通过电镜观察纯化的病毒粒子发现该病毒为直径为10-15nm，长约610-700nm的弯曲线状病毒。为了调查我国马铃薯上PVS的发病情况、强化我国马铃薯S病毒病检测和诊断技术及科学指导防控，急需建立检测PVS经济、高通量的检测技术。目前，对PVS的检测和诊断多采用低效率的指示植物、电镜观察、RT-PCR等方法进行小样本检测。本专利技术以纯化的PVS病毒粒子作为抗原通过杂交瘤技术制备了1株分泌抗PVS的特异性单抗的杂交瘤细胞株，以分泌的单抗为核心建立检测PVS的高通量的血清学方法及试剂盒，从而为我国马铃薯S病毒的检测和诊断、流行病学的调查、无毒种薯的生产、病毒基因组功能的分析及其科学防控体系的建立提供物质和技术支持。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗马铃薯S病毒单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用。分泌抗马铃薯S病毒单抗的杂交瘤细胞株16C10，它能分泌抗马铃薯S病毒的特异性单抗，杂交瘤细胞株16C10于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.12002。一种所述的杂交瘤细胞株分泌的抗马铃薯S病毒单抗，抗马铃薯S病毒单抗腹水间接ELISA效价达10-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，该单抗与马铃薯S病毒34KDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现单抗检测感染PVS病叶的灵敏度分别达到1:81920和1:10240倍稀释(w/v,g/mL)。抗马铃薯S病毒单抗能与马铃薯S病毒有特异性反应，而不与马铃薯A病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯卷叶病毒和健康的马铃薯叶片粗提液反应。抗马铃薯S病毒单抗在该病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法及免疫学试剂盒。本专利技术与现有技术相比具有的有益效果：1)提供的杂交瘤细胞株分泌大量抗马铃薯S病毒特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的ACP-ELISA、dot-ELISA和Tissueblot-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏地检测马铃薯S病毒；2)利用本专利技术所制备的单克隆抗体检测马铃薯S病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3)利用本专利技术所制备的单克隆抗体可有效地用于田间马铃薯S病毒的检测和诊断，也可用于该病毒病的流行病学调查、病毒基因组功能分析、脱毒种薯生产、抗性育种、科学防控等方面。附图说明图1dot-ELISA方法检测PVS的特异性分析；图2dot-ELISA方法检测PVS的灵敏度分析；图3dot-ELISA田间检测PVS代表性结果；图4RT-PCR对田间疑似发病马铃薯样品检测结果；图5Tissueblot-ELISA田间检测PVS代表性结果。生物保藏杂交瘤细胞株16C10于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号为CGMCCNo.12002。具体实施方式分泌抗马铃薯S病毒单抗的杂交瘤细胞株16C10于2016年1月7日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.12002，它能分泌抗马铃薯S病毒的单抗。一种所述的杂交瘤细胞株分泌的抗马铃薯S病毒单抗，抗马铃薯S病毒单抗腹水间接ELISA效价达10-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，该单抗能与马铃薯S病毒34KDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现单抗检测感染PVS病叶的灵敏度分别达到1:81920和1:10240倍稀释(w/v,g/mL)。抗马铃薯S病毒单抗能与马铃薯S病毒有特异性反应，而不与马铃薯A病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯卷叶病毒和健康的马铃薯叶片粗提液反应。抗马铃薯S病毒单抗在该病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。本专利技术提供的杂交瘤细胞株能大量分泌抗马铃薯S病毒单抗，且该细胞株分泌的单抗特异性强、效价高、稳定性好、灵敏度高。以该单抗为核心建立检测PVS的高通量的血清学方法可成功应用于田间PVS的检测，从而为我国马铃薯S病毒病检测和诊断、脱毒种薯的生产、科学防控提供物质和技术支持。下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步说明。一、杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备1.免疫原及检测抗原的制备用下面的操作步骤提纯病毒粒子：1)将组织匀浆器在冰上预冷；2)称取马铃薯组织200g，每100g组织加入200mL0.5M磷酸盐缓冲液即PB缓冲液(含0.01MNa-EDTA和0.1％巯基乙醇，pH7.5)，在组织匀浆器中匀浆5-10min使马铃薯组织充分匀浆，用双层棉纱布过滤匀浆液，滤液6000rpm离心20min去除植物残渣；3)所得的上清液在搅拌中加至终浓度为2.5％TritonX-100、4％PEG(分子量为6000)和0.1MNaCl，然后4℃搅拌4h以上；4)11000rpm离心15min去上清；5)用pH7.5的0.5MPB(含0.01MMgCl2和0.5M脲)将沉淀充分悬浮，6000...
【技术保护点】
一种分泌抗马铃薯S病毒单抗杂交瘤细胞株16C10，其特征在于能分泌抗马铃薯S病毒单抗，所述的杂交瘤细胞株16C10于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12002。
【技术特征摘要】
1.一种分泌抗马铃薯S病毒单抗杂交瘤细胞株16C10，其特征在于能分泌抗马铃
薯S病毒单抗，所述的杂交瘤细胞株16C10于2016年1月7日保藏于中国微生
物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.12002。
2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的抗马铃薯S病毒单抗，其特征在
于该单抗腹水间接ELISA效价达10-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，
与马铃薯S病毒34Kda的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-E...
【专利技术属性】
技术研发人员：周雪平，吴建祥，宋革，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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