杂交瘤细胞株YQQD8及其产生的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体制造技术

本发明专利技术涉及杂交瘤细胞株YQQD8及其产生的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体。杂交瘤细胞株YQQD8，该细胞株YQQD8已于2015年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO.C201534，分类命名为杂交瘤细胞株YQQD8。用常规非竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得YQQD8的鼠腹水抗体的效价可达2.56×106。由其分泌产生的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体可以较好地识别辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素，对辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素的50％抑制浓度IC50依次为8.5ng/mL、5.0ng/mL、13.5ng/mL，对辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素的交叉反应率范围为62.9％-170％；可应用于定量测定辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素总量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及杂交瘤细胞株YQQD8及其产生的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体。
技术介绍
辣椒素类化合物是使辣椒具有辛辣刺激的主要化学物质，其成分主要包括辣椒素、二氢辣椒素、高二氢辣椒素、降二氢辣椒素、高辣椒素等化合物。其中辣椒素和二氢辣椒素约占辣椒素类物质总量的90％，并提供了约90％的辣热感刺激。除了赋予食品辛辣味被用作调味品以外，辣椒素类物质还具有消炎镇痛、抗病菌、抗肿瘤作用，能促进脂肪燃烧、降低血脂，抑制胃酸分泌、对胃黏膜损伤有保护作用等药用价值。在农药领域，辣椒素类物质被认为是一种理想的无公害农药，已有报道被应用于水果、蔬菜、谷物等作物上，免除了耐药性及残留检验。在轻工业领域可被用于高档特种防污涂料，防止海洋水生物对船体的附着；用于电缆材料中以驱赶老鼠啃咬等。合成辣椒素具有与天然辣椒素类似的结构部和功能，且在价格和辣度上比天然辣椒素更占优势，也被广泛应用于医药、杀虫剂、防污涂料、军事武器等领域。因此，辣椒素类物质总量分析测定方法的研究对辣椒产品的研发与标准化及其品质评价意义重大。现有的辣椒素类物质分析检测方法包括感官鉴定法、凯氏定氮法、化学检测法(包括呋喃甲醛法、三氯化铁法和氧氯钒法)、分光光度法、光谱测定法、薄层色谱法、高效液相色谱法、色谱-质谱联用等。其中感官鉴定法是最早评估辣度的方法，虽然简单直接,但检测结果易受主观因素影响，重复性差、敏感度变化大，且香味对辣味的影响、心理上的预料没有标准。化学检测法多用于辣椒素类物质的定性分析。薄层色谱法由于操作复杂费时，且测定结果灵敏度和准确度不高，应用较少。高效液相色谱法、色谱-质谱联用等现代仪器检测方法是辣椒素类物质最常用的检测方法，其灵敏度高、准确性好，但是仪器设备昂贵，，对实验环境要求高，且要求专业操作人员，难以实现快速检测。近年来迅速发展起来的免疫分析方法由于克服了上述方法的缺点，并具有特异性强、灵敏度高、分析容量大、方便快捷、成本低廉、适于现场批量检测等优点，被广泛应用于医学、农学等各个领域。免疫分析是基于抗原、抗体的特异性识别反应的一种分析方法，其核心试剂是高质量的特异性抗体。所以要建立辣椒素类物质总量免疫分析方法，首先要获得抗辣椒素类物质的通用抗体。由于辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素应用较多，且含量相比其他辣椒素类物质多。因此，制得抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用抗体即可满足检测需求。与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有特异性强、稳定性好，一旦建立杂交瘤细胞株后，可连续稳定生产抗体。目前，国内外鲜有针对辣椒素类物质抗体的报道，特别是辣椒素类物质单克隆抗体未见报道。因此，研制辣椒素类物质单克隆抗体不仅填补了辣椒素类物质免疫检测的空白，为辣椒素类物质的快速检测开辟新思路，对实现辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素总量免疫定量检测具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供杂交瘤细胞株YQQD8及其产生的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：提供杂交瘤细胞株YQQD8，该细胞株YQQD8已于2015年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO.C201534，分类命名为杂交瘤细胞株YQQD8。其具有序列表中SEQIDNO.1所示的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体重链可变区编码基因序列和序列表中SEQIDNO.2所示的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体轻链可变区编码基因序列。抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCCNO.C201534的杂交瘤细胞株YQQD8分泌产生。其重链可变区具有序列表中SEQIDNO.3所示的氨基酸序列；轻链可变区具有序列表中SEQIDNO.4所示的氨基酸序列。本专利技术提供的杂交瘤细胞株YQQD8是采用两步筛选法获得的，其具体步骤为：以香兰素胺盐酸盐与丁二酸酐为原料，经一步反应合成人工半抗原化合物，将半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联后即得辣椒素类物质通用人工完全抗原。将BALB/c小鼠经辣椒素类物质通用人工完全抗原免疫2-4次后，用2倍于前一次免疫剂量的辣椒素类物质完全抗原Capsaicin-BSA作最后一次加强免疫，3天后进行细胞融合，融合细胞用液体培养基进行培养。采用ELISA方法分两步进行筛选融合细胞：第一步采用间接ELISA法筛选出抗辣椒素类物质而不抗包被抗原载体蛋白OVA(卵清白蛋白)的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用辣椒素作为竞争，选择吸光值和灵敏度均较高的孔，采用半固体培养基进行亚克隆细胞的培养，克隆后待细胞集落长至肉眼可见大小时，分别将每个细胞集落挑至液体培养基中，采用同样的两步筛选法进行检测，如此重复克隆1次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株YQQD8。本专利技术提供的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体的制备方法，步骤如下：将获得的杂交瘤细胞株YQQD8注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化即得抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体。按上述方案，所述的纯化方法为辛酸-硫酸铵法，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心30min，吸取上清，将所得腹水上清与3倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33μL，室温混合30min，4℃静置2h以上；4℃，12000r/min离心30min，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的0.1mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4℃预冷，冰浴条件下缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体，将抗体冻干粉置-20℃冰箱中备用；所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容至100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化本文档来自技高网...

【技术保护点】
杂交瘤细胞株YQQD8，该细胞株YQQD8已于2015年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO.C201534，分类命名为杂交瘤细胞株YQQD8。

【技术特征摘要】
1.杂交瘤细胞株YQQD8，该细胞株YQQD8已于2015年4月23日保藏于中国典型培养物保
藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO.C201534，分类命
名为杂交瘤细胞株YQQD8。
2.抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体，它由权利便要求1所述的杂交
瘤细胞株YQQD8分泌产生。
3.权利要求2所述的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体的制备方法，
其特征在于：步骤如下：将权利要求1所述的杂交瘤细胞株YQQD8注射预先用福氏不完全佐
剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化即得抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素
通用单克隆抗体。
4.权利要求2所述的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体在辣椒素、二
氢辣椒素、合成辣椒素总量测定中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：应用方法为...

【专利技术属性】
技术研发人员：李培武，杨青青，张奇，马飞，张文，柯艳妮，张良晓，丁晓霞，张兆威，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42