本发明专利技术通过单克隆抗体技术，筛选了一株可分泌特异性识别磷酸化AEG‑1的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏编号是CCTCC NO:C2016101，保藏日期是2016年5月31日。本发明专利技术还公开了上述杂交瘤细胞株分泌的抗磷酸化AEG‑1的单克隆抗体及其在检测磷酸化AEG‑1试剂中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于单克隆抗体
，具体涉及一种抗磷酸化AEG-1的特异性单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株。
技术介绍
癌症的发生是一个复杂、多阶段、多因素的过程，与基因突变，表观遗传学改变，肿瘤微环境，免疫系统的功能状态都有密切的关系。星形胶质细胞升高基因-1(AstrocyteElevatedGene-1，AEG-1)，也叫Metadherin(MTDH)，或Lysine-richCEACA-M1co-isolated(LYRIC)。近年来研究发现它促进细胞的生长、迁移、侵袭和恶性转化，血管生成，抑制细胞凋亡，在肿瘤的发生、发展、转移、复发以及化疗药物的耐药性中发挥重要的作用[1]。大量在人组织标本上的研究表明AEG-1在乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌，前列腺癌、卵巢癌、肝癌、胆囊癌、肾细胞癌、脑胶质瘤、恶性黑色素瘤等多种肿瘤中的表达增高，其过表达与多种肿瘤临床预后不良有关[2]。因此，AEG-1有望成为肿瘤的诊断指标，肿瘤进程和治疗效果的监控指标，以及肿瘤治疗的新的分子靶标。近年来的研究发现，人AEG-1基因位于8号染色体长臂22区(8q22)，全长的cDNA有3611bp，其开放阅读框从220bp至1968bp，编码的AEG-1蛋白有582个氨基酸，分子重量约64kDa。结构分析显示，它的52-74位氨基酸具有跨膜区域的特征，但是它是属于Ⅰb类跨膜蛋白(C末端在胞浆内)还是II类跨膜蛋白(C末端在细胞外)，目前仍有争论[3,4]。它有三个富含核定位信号的区域(NLS1-3)，分别位于用79-91位氨基酸(NLS1)、432-451位氨基酸(NLS2)、561-580位氨基酸(NLS3)。NLS区域与蛋白的胞浆和胞核定位，泛素化修饰有关(图1)[3,5]。用特异性抗体能检测到AEG-1在细胞内有多种亚型，分子量除64kDa外，还可能有105kDa，80kDa，70kDa，50kDa，35kDa和20kDa，可能与翻译后剪切或修饰有关[4-7]。AEG-1富含赖氨酸(12.3％)和丝氨酸(11.6％)，可能受到乙酰化，磷酸化及泛素化修饰[7]。根据UniProtKB提供的信息(http://www.uniprot.org/uniprot/Q86UE4)，多项蛋白质谱的研究发现，AEG-1的多个丝氨酸、苏氨酸位点存在磷酸化状态。目前，尚未有研究证实AEG-1磷酸化修饰的存在。我们既往的研究发现，在多种人胃癌细胞株上，AEG-1促进胃癌细胞的生长；在胃癌组织中表达增高，与pTNM分期相关，并与弥漫型胃癌和晚期肿瘤相关[8]。我们最近用蛋白质谱的研究发现，在胃癌细胞上AEG-1第426位丝氨酸存在磷酸化状态，细胞因子CXCL12可下调该位点的磷酸化，提示该位点的磷酸化修饰可能具有生理功能或病理作用。目前，尚没有关于第426位丝氨酸磷酸化修饰的AEG-1的功能和在人肿瘤组织中表达情况的研究报道。因此，目前缺乏能够特异性检测磷酸化AEG-1的抗体，以及能够分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。抗磷酸化AEG-1的单克隆抗体可作为AEG-1磷酸化修饰生物学功能研究的重要工具，用于Westernblot、免疫荧光、免疫组化等实验，也有助于肿瘤的临床诊断，并指导临床治疗。参考文献：1.Emdad,L.,etal.,AEG-1/MTDH/LYRIC:signalingpathways,downstreamgenes,interactingproteins,andregulationoftumorangiogenesis.AdvCancerRes,2013.120:p.75-111.2.Shi,X.andX.Wang,TheroleofMTDH/AEG-1intheprogressionofcancer.IntJClinExpMed,2015.8(4):p.4795-807.3.Huang,Y.andL.P.Li,Progressofcancerresearchonastrocyteelevatedgene-1/Metadherin(Review).OncolLett,2014.8(2):p.493-501.4.Hu,G.,Y.Wei,andY.Kang,ThemultifacetedroleofMTDH/AEG-1incancerprogression.ClinCancerRes,2009.15(18):p.5615-20.5.Thirkettle,H.J.,etal.,NuclearLYRIC/AEG-1interactswithPLZFandrelievesPLZF-mediatedrepression.Oncogene,2009.28(41):p.3663-70.6.Sutherland,H.G.,etal.,3D3/lyric:anoveltransmembraneproteinoftheendoplasmicreticulumandnuclearenvelope,whichisalsopresentinthenucleolus.ExpCellRes,2004.294(1):p.94-105.7.Luxton,H.J.,etal.,RegulationofthelocalisationandfunctionoftheoncogeneLYRIC/AEG-1byubiquitinationatK486andK491.MolOncol,2014.8(3):p.633-41.8.Huang,W.,etal.,AEG-1isatargetofperifosineandisover-expressedingastricdysplasiaandcancers.DigDisSci,2013.58(10):p.2873-80.
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，提供一种分泌特异识别第426位丝氨酸磷酸化的AEG-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本专利技术还要解决的技术问题是，提供抗第426位丝氨酸磷酸化的AEG-1的单克隆抗体。本专利技术最后要解决的技术问题是，将上述单克隆抗体用于磷酸化AEG-1的检测，特别是用多种不同方法检测磷酸化AEG-1在细胞组织中的表达情况。一株杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株命名为AEG-1-P，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏编号是CCTCCNO:C2016101，保藏日期是2016年5月31日。一种抗磷酸化AEG-1的单克隆抗体，它是由上述杂交瘤细胞株分泌。所述单克隆抗体是利用分子生物学技术合成了一段包含该426位丝氨酸磷酸化的多肽(Ac-QKVS(p)DDDKEKC-NH2)，并连接到免疫原性增强因子(ImmunogenicityEnhancementFactors,IEFs)上，以此为抗原免疫小鼠后，采用杂交瘤技术经过一系列的筛选和亚克隆，制备出的。该细胞株分泌的单克隆抗体，经dotblot验证，能够特异性识别丝氨酸发生磷酸化的肽段。免疫分型实验证实，该单克隆抗体为IgG2a。上述抗磷酸化AEG-1的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)抗体的制备：将杂交瘤细胞株CCTCC-C2016101培养至密度1×106个/ml后，再过夜培本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株杂交瘤细胞株，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏编号是CCTCC NO:C2016101，保藏日期是2016年5月31日。
【技术特征摘要】
1.一株杂交瘤细胞株，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏编号是CCTCCNO:C2016101，保藏日期是2016年5月31日。2.一种抗磷酸化AEG-1的单克隆抗体，其特征在于，它是由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌。3.权利要求2所述的抗磷酸化AEG-1的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)抗体的制备：将杂交瘤细胞株CCTCCNO:C2016101培养至密度1×106个/ml后，再过夜培养12小时，收集细胞，取6周龄雌性BALB/c小鼠注射细胞悬液，10～14天收集腹水。(2)腹水ProteinG纯化：腹水12000...
【专利技术属性】
技术研发人员：王雪融，黄文斌，苏东明，吴丹丹，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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