本发明专利技术涉及二氢辣椒素多克隆抗体免疫吸附剂、免疫亲和柱及其制备方法和应用。该免疫吸附剂包括固相载体和该固相载体上偶联的二氢辣椒素多克隆抗体，所述二氢辣椒素多克隆抗体是采用式Ⅰ所述的二氢辣椒素人工半抗原(E)-4-[2-甲氧基-4-(壬酰胺甲基)苯氧基]-4-氧-2-丁烯酸与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到的二氢辣椒素人工抗原免疫动物，并分离纯化后冷冻干燥获得的。本发明专利技术的免疫亲和柱能够与二氢辣椒素特异性结合，最大柱容量为220-250ng；采用甲醇进行洗脱，添标回收率可达83.1％，RSD均小于6％。可用于二氢辣椒素含量的样品前处理，操作简单、成本低、效率高、有机试剂消耗少。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及二氢辣椒素多克隆抗体免疫吸附剂、免疫亲和柱及其制备方法和应用。该免疫吸附剂包括固相载体和该固相载体上偶联的二氢辣椒素多克隆抗体，所述二氢辣椒素多克隆抗体是采用式Ⅰ所述的二氢辣椒素人工半抗原(E)-4--4-氧-2-丁烯酸与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到的二氢辣椒素人工抗原免疫动物，并分离纯化后冷冻干燥获得的。本专利技术的免疫亲和柱能够与二氢辣椒素特异性结合，最大柱容量为220-250ng；采用甲醇进行洗脱，添标回收率可达83.1％，RSD均小于6％。可用于二氢辣椒素含量的样品前处理，操作简单、成本低、效率高、有机试剂消耗少。【专利说明】一种二氢辣椒素多克隆抗体免疫吸附剂、免疫亲和柱及其 制备方法和应用
： 本专利技术涉及二氢辣椒素多克隆抗体免疫吸附剂、免疫亲和柱及其制备方法和应 用。
技术介绍
近年来，把非正常食用油（俗称地沟油）掺入合格食用油中以获取利益的行为屡 禁不止，严重威胁着消费者的健康，成为当前我国食品安全领域亟须解决的问题。在我国传 统饮食习惯中辣椒是使用量较大、应用范围广泛的调味品，二氢辣椒素是引起辣味的主要 化学成分，主要存在于辣椒属植物的果实及种子中。二氢辣椒素具有脂溶性、强稳定性好、 沸点高等性质，而餐饮行业的泔水油是地沟油的主要来源之一，目前地沟油加工方法很难 完全去除具有以上性质的化合物。正常食用油基本不含二氢辣椒素，而接触过辣椒的餐厨 废弃油脂难以避免地含有这类成分，因此二氢辣椒素能够作为鉴别餐厨废弃油脂的特征指 标。 现有二氢辣椒素的检测方法包括薄层层析法和精密仪器分析法，薄层层析法是较 早用于检测二氢辣椒素的常规检测方法，该法不需要特殊的仪器设备，一般实验室都可进 行，但有机试剂用量大、步骤繁琐、其它组分干扰严重、准确性差，不能准确定量，且对实验 人员和周围环境污染危害较大、刺激性强，不适于现场快速检测。精密仪器分析法主要包 括高效液相色谱法（HPLC)和液相色谱质联用法（LC-MS/MS)，这些方法灵敏度高，准确性 好，然而要求二氢辣椒素样品纯化程度高，传统的样品前处理技术，如液-液萃取、固相萃 取、固相微萃取等，前处理过程繁琐、特异性不强。因此，建立快捷有效的样品前处理技术已 成为二氢辣椒素检测分析中需解决的首要和瓶颈问题。免疫亲和色谱柱（Immunoaffinity Chromatography)是一种新型高效的样品前处理技术，利用抗原抗体结合的高度特异性和 亲和力，用化学偶联键合方法将特异性抗体结合到层析吸附剂上，基于抗原抗体间特异性 的可逆结合来实现对复杂样品中目标物质的富集净化。目前，尚未见有二氢辣椒素多克隆 抗体免疫亲合柱的相关报道。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种二氢辣椒素多克隆抗体免疫吸附剂、其制备方法及其在样 品检测中的应用。 为解决实现本专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下： -种二氢辣椒素多克隆抗体免疫吸附剂，其特征在于：该免疫吸附剂包括固相载 体和该固相载体上偶联的二氢辣椒素多克隆抗体，所述二氢辣椒素多克隆抗体是采用式I 所述的二氢辣椒素人工半抗原（E)-4_-4-氧-2-丁 烯酸与牛血清白蛋白（BSA)偶联得到的二氢辣椒素人工抗原免疫动物，并分离纯化后冷冻 干燥获得的二氢辣椒素多克隆抗体， 【权利要求】1. 一种二氢辣椒素多克隆抗体免疫吸附剂，其特征在于：所述免疫吸附剂包括固相载 体和该固相载体上偶联的二氢辣椒素多克隆抗体，所述二氢辣椒素多克隆抗体是采用式I 所述的二氢辣椒素人工半抗原（E)-4--4-氧-2-丁 烯酸与牛血清白蛋白（BSA)偶联得到的二氢辣椒素人工抗原免疫动物，并分离纯化后冷冻 干燥获得的二氢辣椒素多克隆抗体，2. 根据权利要求1所述的二氢辣椒素多克隆抗体免疫吸附剂，其特征在于：所述的免 疫为将二氢辣椒素人工抗原采用弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂乳化后间隔重复免疫动 物，其中；初次免疫用弗氏完全佐剂，后续免疫用弗氏不完全佐剂，至抗血清效价达到4000 以上，即处死Balb/c小鼠，取全部抗血清；所述的纯化为辛酸硫酸铵法纯化。3. 根据权利要求1所述的二氢辣椒素多克隆抗体免疫吸附剂，其特征在于：所述的二 氢辣椒素人工半抗原通过Ν，Ν'-二环己基碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)活化后，再 与牛血清白蛋白进行偶联得到。4. 根据权利要求1所述的二氢辣椒素多克隆抗体免疫吸附剂，其特征在于：所述固相 载体为琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺硅胶微球。5. 权利要求1所述的二氢辣椒素多克隆抗体免疫吸附剂的制备方法，其特征在于： 所述固相载体选用聚丙烯酰胺硅胶微球时，制备方法为：将聚丙烯酰胺硅胶微球用纯 水和pH = 6的磷酸盐缓冲液交替冲洗，用pH = 6的磷酸盐缓冲液配得聚丙烯酰胺硅胶微 球微球悬浮液；用pH = 6的磷酸盐缓冲液溶解二氢辣椒素多克隆抗体，然后逐滴加入到聚 丙烯酰胺硅胶微球悬浮溶液中，再加入碳二亚胺（EDC)，4°C条件搅拌反应20-22h后，得到 以聚丙烯酰胺硅胶微球为固相载体的二氢辣椒素多克隆抗体免疫吸附剂； 所述固相载体选用琼脂糖凝胶时，制备方法为：将琼脂糖凝胶经盐酸反复冲洗去除杂 质活化后溶于偶联缓冲液中，加入上述二氢辣椒素多克隆抗体，在室温条件下搅拌，得到琼 脂糖凝胶溶液，然后将琼脂糖凝胶溶液中未与琼脂糖凝胶偶联的抗体溶液过滤后，用偶联 缓冲液冲洗琼脂糖凝胶，再加入〇. 1M，pH = 8. 0的Tris-HCl缓冲液，室温反应I. 5-2. 5h， 然后用0. 1M，pH = 8. 0的Tris-HCl缓冲液和0. 1M，pH = 4. 0的Tris-HCl缓冲液交替冲洗 琼脂糖凝胶，除去未偶联的二氢辣椒素多克隆抗体及其他杂质，得到纯化的二氢辣椒素多 克隆抗体免疫吸附剂。6. 根据权利要求5所述的二氢辣椒素多克隆抗体免疫吸附剂的制备方法，其特征在 于： 所述固相载体选用聚丙烯酰胺硅胶微球时：聚丙烯酰胺硅胶微球、二氢辣椒素多克隆 抗体、碳二亚胺的质量比为0. 4-1. 2g :0. 8-4. Omg :28-84mg ;所述pH = 6的磷酸盐缓冲液的 体积和聚丙烯酰胺硅胶微球质量的比例为l_5mL/g ; 所述固相载体选用琼脂糖凝胶时：所述琼脂糖凝胶和二氢辣椒素多克隆抗体的质量比 为0. 2-0. 6g :0. 4-2mg ;所述溶解琼脂糖凝胶的偶联缓冲液的体积和琼脂糖凝胶的质量的 比例为 20-40mL/g。7. 装载有权利要求1所述的二氢辣椒素多克隆抗体免疫吸附剂的二氢辣椒素多克隆 抗体免疫亲和柱。8. 权利要求7所述的二氢辣椒素多克隆抗体免疫亲和柱的制备方法，其特征在于：具 体步骤如下：首先将权利要求1所述的二氢辣椒素多克隆抗体免疫吸附剂填充于固相萃取 柱中，加入0. 01M，pH = 6的磷酸盐缓冲液后自然沉淀，然后用0. 01M，pH = 6的磷酸盐缓冲 液洗涤，保存于含〇. 〇2wt %叠氮钠的pH 6,0. OlM的磷酸盐缓冲液。9. 权利要求7所述的二氢辣椒素多克隆抗体免疫亲和柱的应用，其特征在于，利用权 利要求7所述的二氢辣椒素多克隆抗体免疫亲和柱对上机前的样品提取液进行富集与净 化。10. 根据权利要求9所本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种二氢辣椒素多克隆抗体免疫吸附剂，其特征在于：所述免疫吸附剂包括固相载体和该固相载体上偶联的二氢辣椒素多克隆抗体，所述二氢辣椒素多克隆抗体是采用式Ⅰ所述的二氢辣椒素人工半抗原(E)‑4‑[2‑甲氧基‑4‑(壬酰胺甲基)苯氧基]‑4‑氧‑2‑丁烯酸与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到的二氢辣椒素人工抗原免疫动物，并分离纯化后冷冻干燥获得的二氢辣椒素多克隆抗体，
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李培武，马飞，张奇，杨青青，张良晓，丁小霞，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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