透明质酸结合蛋白多克隆抗体的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种透明质酸结合蛋白多克隆抗体的制备方法，属于生化手段测试技术领域。以HABP作为抗原进行注射，制备HABP抗血清，对该抗血清进行分离并采用二级层析法对该抗血清进行纯化，二级层析法包括一级层析和二级层析，所述的一级层析采用Protein A亲和层析填料，将抗血清中IgG分离纯化；二级层析采用CNBr预活化的琼脂糖填料，将HABP挂柱后，从一级纯化分离的IgG中分离Anti‑HABP，即得透明质酸结合蛋白多克隆抗体。将发明专利技术应用于透明质酸结合蛋白多克隆抗体的指标，具有稳定性好、纯度高等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种透明质酸结合蛋白多克隆抗体的制备方法，属于生化手段测试

技术介绍
透明质酸（HyaluronicAcid），是一种由N-乙酰氨基葡萄糖β-D-葡糖糖醛酸交替聚合而成的高分子粘多糖，是结缔组织基质中的主要成分，HA由间质细胞合成，由淋巴进入血液循环，肝脏内皮细胞是摄取和降解HA的主要部位。近年研究发现肝脏细胞外基质与肝纤维化密切相关，ECM在肝脏内合成与降解之动态平衡一旦失调则可形成肝纤维化，甚则导致肝硬化。在ECM中，HA的作用日益受到重视，它的含量也是身体健康的一个标准，例如当肝损伤越严重时，它的含量升高等等。实验研究发现，慢迁肝、慢活肝、肝硬化患者血清HA含量逐步升高，HA不仅能反映肝纤维化，也能反映肝功能的损伤程度。除了在肝脏发生纤维化的时候HA含量会发生变化外，肾脏纤维化的检测同样适用，实验表明慢性肾功能衰竭早期和中期的血清透明质酸值与肾脏纤维化病变正相关，在排除其余器官病变的情况下，HA可以作为肾组织纤维化的早、中期实验室指标。所以，结合运用较为普遍且廉价的血清学指标，作为早期评估肾纤维化发生、发展的临床无创性的诊断指标和疗效评价，有一定的临床诊断意义及较高的临床应用价值。对体内物质含量的检测，可以通过该物质相应的抗体含量的检测来相应的表征体内该物质含量变化。因此，在免疫分析方法的建立过程中，抗体的制备是关键步骤、一般认为，分子量越大、结构越复杂的物质免疫原性越强。然而，目前人们所关注的很多物质，都属于小分子化合物，其分子量一般小于能直接用于免疫动物抗原分子的分子量下限（5000Da）。这些小分子化合物需要通过与某些载体蛋白分子结合（称为全抗原）才能具有免疫原性，以诱导动物产生针对该小分子化合物的抗体。透明质酸免疫原性极弱，不能直接获得抗体，HABP（透明质酸结合蛋白）是近年来发现能与HA特异性结合的抗体，且极少与其他物质结合，且HA与HABP结合表现出功能的多样性可以用来作为HA的特异性抗体。所以，免疫分析检测时，利用HABP结合血清中的HA分子，使其形成复合物全抗原，通过全抗原的含量测定来表征体内HA含量的变化，以监测机体病理状况。抗体是机体受到抗原刺激免疫细胞产生分泌的免疫物质。它主要是由效应B细胞（浆细胞）分泌的物质，当机体或者有外来的物质如病毒或者细菌等进入后，是免疫系统用来识别与鉴定的物质。实验发现，它存在于脊椎动物的血液，淋巴液等一些体液以及B细胞的细胞膜表面。抗体能够鉴定并识别出非自身机体产生的外来物的独特特征的能力，这种能被抗体识别出的外来的物质称为抗原物质。近年来，用于疾病研究、诊断的抗体主要来源于哺乳动物的单克隆抗体和多克隆抗体。多克隆抗体是研究和应用最早的抗体，其制备方法简便而且经济。因为相对于单克隆抗体而言，多克隆在其制备和纯化上相对比较简单，而且可以在经过对机体的第一次免疫之后可以连续的得到相对较多的抗体的量。因此，在关于诊断疾病的方面，抗体得到了广泛的应用。而多克隆抗体制备方法简便，但所制备的抗体容易受到温度、pH等因素的影响，稳定性不佳。基于此，做出本申请。
技术实现思路
针对现有抗体制备中所存在的上述缺陷，本申请提供一种纯度高、稳定性好的透明质酸结合蛋白多克隆抗体的制备方法。为实现上述目的，本申请采取的技术方案如下：透明质酸结合蛋白多克隆抗体的制备方法，以HABP作为抗原进行注射，制备HABP抗血清，对该抗血清进行分离并采用二级层析法对该抗血清进行纯化，二级层析法包括一级层析和二级层析，所述的一级层析采用ProteinA亲和层析填料，将抗血清中IgG分离纯化；二级层析采用CNBr预活化的琼脂糖填料，将HABP挂柱后，从一级纯化分离的IgG中分离Anti-HABP，即得透明质酸结合蛋白多克隆抗体。进一步的，作为优选：所述的HABP作为抗原注射前，采用超声乳化法将其包被入佐剂中形成乳化物进行注射。具体乳化方法为：移取人源透明质酸结合蛋白HABP与佐剂并将混合物立即置于0℃冰浴，用超声波对其进行超声乳化，每超声10秒钟后停止超声30秒，重复超声20个循环，超声乳化完成后停止超声，乳化物仍置于冰浴中。所述的抗血清制备时采用多次免疫法，更优选的，所述的抗血清制备采用四次免疫，第一次免疫时采用人源透明质酸结合蛋白HABP与完全佐剂形成的乳化物，第二次免疫采用人源透明质酸结合蛋白HABP与不完全佐剂形成的乳化物。所述的抗分离抽取方式为：抽取全血，将其在4℃的条件下以每分钟4000转的速度离心10分钟后，去掉上清液，将下层血清置于-20℃条件下保存。所述的一级层析中，先填装抗体蛋白亲和柱，再加入煮好的琼脂糖，并加入proteonA作为填料，移取血清，并将其稀释，加入亲和柱内，按1:1的比例加入结合/洗涤缓冲液反复清洗亲和层析柱内充填的物料，过滤出水相，当滤水相中蛋白质核酸测定波长趋近于0时，亲和层析柱内剩下的即为与填料ProteinA相结合的IgG，用洗脱液elutionbuffer洗脱玻璃亲和柱内的混合物，即可得到亲和纯化后的IgG。所述的二级层析中，向以CNBr预活化的琼脂糖为填料上加入透明质酸结合蛋白，使透明质酸结合蛋白与层析柱中的基质共价交联结合，形成层析柱，加入亲和纯化后的IgG，使IgG中的透明质酸结合蛋白多克隆抗体与琼脂糖填料中的透明质酸结合蛋白特异性结合，用洗涤缓冲液洗涤，去除交联聚合物中HABP的部分，分离出与蛋白特异性结合的抗体。附图说明图1为本申请中ELISA抗体检测（I加了TSG，II加了rHABP，CK为对照组，加了没有对兔子进行免疫时的血清）；图2为本申请中纯化后ELISA抗体检测（I加了TSG，II加了rHABP，CK为未注射抗原前的兔血清检测结果，作为对照组）图3为HABP纯度检测电泳图；图4为二次免疫血清电泳图；图5为亲和层析电泳图；图6为免疫亲和层析电泳图。具体实施方式以下以新西兰兔作为处理对象进行技术方案的说明。1试验材料1.1实验动物实验用新西兰兔购自浙江省医学科学院，每天用专用饲料饲育兔子，早晚各一次，提供充足的饮用水。人源透明质酸结合蛋白实验用透明质酸结合蛋白（HABP1）由实验室前期克隆调控人源HABP1基因，并将基因转入大肠杆菌表达得到重组表达的HABP1。将蛋白在-80℃条件下加20%甘油保存。主要试剂及配制1.3.1SDS-PAGE实验用试剂分离胶缓冲液：在70mL蒸馏水中加入三羟甲基氨基甲烷18.15g，用盐酸调节pH，当在8.8时停止滴加，加蒸馏水定容摇匀至100mL。10%过硫酸铵溶液：取过硫酸铵10.00g加纯化水定容摇匀至100mL30%丙烯酰胺溶液：称取亚甲基双丙烯酰胺0.80g和丙烯酰胺30.00g加纯化水定容摇匀至100mL，并且避光条件下保存。浓缩胶缓冲液：在70mL蒸馏水中加入三羟甲基氨基甲烷6.00g，用盐酸调节pH，当在6.8时停止滴加，加蒸馏水定容摇匀至100mL。电泳缓冲液：天平称得甘氨酸144.00g，三羟甲基氨基甲烷30.00g和十二烷基硫酸钠10.00g，将三者加入到蒸馏水中溶解，定容摇匀到1000mL。需要使用时稀释10倍。供试品缓冲液：天平称取十二烷基硫酸钠0.80g，溴酚蓝2mg和三羟甲基氨基甲烷0.303g，甘油4mL，盐酸0.189mL加蒸馏本文档来自技高网...

【技术保护点】
透明质酸结合蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：以HABP作为抗原进行注射，制备HABP抗血清，对该抗血清进行分离并采用二级层析法对该抗血清进行纯化，二级层析法包括一级层析和二级层析，所述的一级层析采用Protein A亲和层析填料，将抗血清中IgG分离纯化；二级层析采用CNBr预活化的琼脂糖填料，将HABP挂柱后，从一级纯化分离的IgG中分离Anti‑HABP，即得透明质酸结合蛋白多克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.透明质酸结合蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：以HABP作为抗原进行注射，制备HABP抗血清，对该抗血清进行分离并采用二级层析法对该抗血清进行纯化，二级层析法包括一级层析和二级层析，所述的一级层析采用ProteinA亲和层析填料，将抗血清中IgG分离纯化；二级层析采用CNBr预活化的琼脂糖填料，将HABP挂柱后，从一级纯化分离的IgG中分离Anti-HABP，即得透明质酸结合蛋白多克隆抗体。2.如权利要求1所述的透明质酸结合蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的HABP作为抗原注射前，采用超声乳化法将其包被入佐剂中形成乳化物进行注射。3.如权利要求2所述的透明质酸结合蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的乳化方法为：移取HABP与佐剂并将其立即置于0℃冰浴下进行超声乳化，每超声10秒钟后停止超声30秒，重复超声20个循环，超声乳化完成后停止超声，乳化物仍置于冰浴中。4.如权利要求1所述的透明质酸结合蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的抗血清制备时采用多次免疫法。5.如权利要求1或4所述的透明质酸结合蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的抗血清制备采用四次免疫，第一次免疫时采用人源透明质酸结合蛋白HABP与完全佐剂形成的乳化物，第二次免疫采用人源透明质酸结合蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：寿建昕，方朝君，郑江萍，余莎，梅雪娜，孔伟晶，
申请(专利权)人：浙江达美生物技术有限公司，绍兴文理学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33