透明质酸化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明专利技术提供了一种透明质酸测定试剂盒及其制备方法。根据本发明专利技术的试剂盒包括：１）透明质酸校准品；２）亲和素化的固相载体；３）生物素化的透明质酸多克隆抗体或单克隆抗体；４）透明质酸结合蛋白的标记物；５）化学发光底物；以及６）洗涤液。进一步，根据本发明专利技术制备上述试剂盒的方法包括以下步骤：１）以透明质酸纯品配制校准品；２）以亲和素包被载体；３）使透明质酸的多克隆抗体或单克隆抗体生物素化；４）用标记物标记透明质酸结合蛋白；５）配制化学发光底物；６）配制洗涤液；７）分装上述校准品、标记物、化学发光底物和洗涤液；以及８）组装为成品。本发明专利技术的试剂盒具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。

Hyaluronic acid chemiluminescence immunoassay assay kit and preparation method thereof

The invention relates to the field of immunoassay medicine, in particular, the present invention provides a hyaluronic acid determination kit and a preparation method thereof. According to the kit of the invention includes: 1) hyaluronic acid calibrator; 2) affinity solid carrier biotinylated hyaluronic acid; 3) biotinylated polyclonal antibody or monoclonal antibody; 4) hyaluronic acid binding protein marker; 5) chemiluminescence substrate; and 6) washing liquid. Further, the preparation method of the invention of the kit includes the following steps: 1) calibration preparation with hyaluronic acid and pure product; 2) with streptavidin labeled carrier; 3) the hyaluronic acid polyclonal or monoclonal antibody biotin; 4) marker hyaluronic acid binding protein marker; 5) preparing the chemiluminescence substrate; 6) preparing the washing liquid; 7) packing the calibrator, marker, chemiluminescent substrate and washing liquid; and 8) assembled into finished products. The kit has the advantages of simplicity, fast, sensitivity, stability and the like.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫分析医学领域，具体地，本专利技术提供了一种透明质酸 (hyaluronic acid,以下简称HA)生物素-亲和素间接包被技术结合化学发光免疫 分析技术测定试剂盒及其制备方法。
技术介绍
透明质酸是一种大分子氨基多糖，由间质细胞合成，在体内参与基质的构成， 主要由肝窦内皮细胞摄取和分解。由于HA主要在肝脏内代谢，肝病患者尤其是 肝硬化患者HA代谢障碍，血中HA浓度显著升高，因而HA是肝硬化的一个良好 血清学指标。HA实验室检测方法主要为免疫分析，常用检测方法为放射免疫分析 (RIA)和酶免疫分析(EIA),目前使用最广的为酶免疫分析(EIA )。化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay, CLIA)是近十年来在 世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析，是继放射免疫分析(RIA)和酶免 疫分析(EIA)之后发展起来的一种超高灵敏度的微量测定技术。具有高灵敏度、 检测范围宽、操作简便快速、标记物稳定性好、无污染、仪器简单经济等优点。 它是放射性免疫分析与普通酶免疫分析的取代者，是目前免疫定量分析最理想的 方法。亲和素-生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，其中包括反应信号放大、 间接包被等形式。反应信号放大即为生物素化的抗原或抗体与酶标记的亲和素反 应体系，其优点是利用生物素-亲和素放大效应提高检测灵敏度，缺点为亲和素的 等电点较高，对聚苯乙烯等固相载体有较高的非特异吸附而导致较高的本底。本 专利技术以亲和素包被固相载体，通过亲和素-生物素系统间接包被生物素化的抗体，不仅便于放大生产、易于监控生产过程，而且避免了直接包被固相存在的活性损 失大、工艺优化繁瑣等缺点，同时保证了批次间的稳定性。本专利技术的目的是为了解决目前临床上放免试剂有效期短、放射性废弃物污染 危害以及酶免试剂灵敏度低、精密性差等不足。本专利技术的透明质酸化学发光测定 试剂盒，经临床实验证明，操作简便，灵敏度高，特异性好，与肝活检结果符合 度极高，提供了一种高效、灵敏、稳定、特异的无创肝纤维化诊断技术。
技术实现思路
本专利技术将生物素-亲和素间接包被技术结合化学发光技术与透明质酸的免疫 分析法有效地结合，提供了一种能够简便、快速、灵敏、'稳定地检测透明质酸的 试剂盒。本专利技术的试剂盒克服了放免试剂和酶免试剂的诸多不足，适于在产业上 有效地推广应用。本专利技术的目的是提供一种生物素-亲和素间接包被技术结合化学发光免疫分 析测定透明质酸的试剂盒。本专利技术的再一 目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。根据本专利技术的试剂盒包括l)透明质酸校准品；2)亲和素化的固相载体；3) 生物素化的透明质酸多克隆抗体或单克隆抗体；4)透明质酸结合蛋白标记物；以 及5)上述标记物所作用的化学发光底物。根据本专利技术的试剂盒，其中，所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁 性颗粒；所述标记物为酶标记物或化学发光剂标记物；所述酶为^5威性磷酸酶或辣 根过氧化物酶；所述化学发光剂为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺；所述化学发光底 物为1,2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺、异鲁米诺或过氧化氢，其中所述l，2-二氧乙 烷类衍生物为(金刚烷)-l,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-曱氧基-4-(3-磷酰氧基) 苯基-1, 2-二氧乙烷(AMPPD)、 CSPD或CDP-Star。进一步，本专利技术提供了一种制备上述试剂盒的方法，包括以下步骤1) 以透明质酸纯品配制透明质酸校准品；2) 固相载体包被亲和素；3) 使透明质酸的多克隆抗体或单克隆抗体生物素化；4) 标记透明质酸结合蛋白； 5 )配制化学发光底物；6) 配制洗涤液；7) 分装上述透明质酸校准品、生物素化的透明质酸的多克隆抗体或单克隆抗 体、透明质酸结合蛋白标记物、化学发光底物和洗涤液；以及8) 组装为成品。本专利技术的方法，其特征在于，所述固相载体包被亲和素的步骤2)采用以下方法用0.050MpH值为9.6的碳酸盐緩冲液配制成所需浓度的亲和素包被液，并将 包被液负载于固相载体上；经生理盐水洗涤、BSA封闭，抽湿干燥后用铝箔袋密 封。在上述方法中，优选，所述亲和素的固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或 磁性颗粒；所述标记物为酶标记物或化学发光剂标记物；所述酶为碱性磷酸酶或 辣根过氧化物酶；所述化学发光剂为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺；所述化学发光 底物为1，2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺、异鲁米诺或过氧化氢，其中所述l,2-二 氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-l,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3 〃 -磷酰氧基)苯基-1, 2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。具体的上述试剂盒可以包括透明质酸校准品、亲和素化的微孔板、生物素化 的抗体、酶标记物与化学发光底物液、20倍浓缩洗涤液等。其中，所述透明质酸 校准品为标准级，纯度不低于卯％,亲和素化的微孔板为48或96孔的微孔板条， 标记酶为辣根过氧化物酶(HRP),化学发光底物液为鲁米诺，浓缩洗涤液为PBST, 或者标记酶为碱性磷酸酶(ALP),化学发光底物液为AMPPD,浓缩洗涤液。本专利技术透明质酸化学发光免疫分析测定试剂盒可以非常专一地检测出血 清或血浆中透明质酸的含量，可以根据透明质酸含量的多少判断肝纤维化的治疗 效果及其病情的变化。它具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。该透明质酸测定 试剂盒(化学发光法)的各项指标均达到同类试剂盒的分析法水平。并且，根据 本专利技术的检测系统为开放式操作，简便快速，不需要昂贵的全自动化学发光测量 仪，特别适合广大的中小医院推广使用，为临床诊断和科研工作提供一种非常有 价值的检测手段。根据本专利技术的试剂盒，载体上包被的亲和素、生物素化抗体、 被测样品的透明质酸以及标记的透明质酸结合蛋白形成夹心结构，本专利技术采 用的两步法反应模式，既有效地利用了化学发光技术原理，又确保了检测的 灵敏度。本专利技术的试剂盒以氧化还原反应产生的光信号代替酶免疫分析中的显色底 物，因而具有与酶免疫分析同等的特异性，而灵敏度大大提高。本专利技术的试剂盒也可以采用亲和素包被固相，与生物素化抗体和待测样本中 透明质酸形成固相亲和素-生物化抗体-透明质酸复合物，再与吖咬酯标记的透明质 酸结合蛋白形成固相亲和素-生物素化抗体-透明质酸-吖。定酯标记透明质酸结合蛋 白夹心复合物，然后加入化学发光底物，利用化学发光仪检测相对发光强度，定 量分析待测样本中透明质酸的含量，从而避免了酶免试剂存在的灵敏度低、内源 性酶干扰、底物大部分有毒或致癌等缺点，该试剂盒具有反应速度快、光信号不受温度变化影响、成本低、易储存等优势，可为肝纤维化诊断提供更为特异、快速、可靠的诊断依据。附图说明图1为实施例1所制备的试剂盒中的校准品线性图。图2本专利技术试剂盒与HA酶联免疫检测试剂盒的相关性具体实施例方式实施例1制备本专利技术的透明质酸化学发光免疫分析测定试剂盒一、 酶标透明质酸结合蛋白的制备和生物素偶联抗体的制备1 、采用戊二醛法或改良的过碘酸钠法将透明质酸结合蛋白与辣根过氧化物酶偶联。2、 生物素偶联透明质酸多克隆抗体或单克隆抗体的制备(1)用常规方法将生物素(BNHS)溶于N, N-二甲基曱酰胺(DMF)配成lmg/mL;(2 )用0.1mol/LpH值为9.0的NaHC0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种透明质酸化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：　１）透明质酸校准品；　２）亲和素化的固相载体；　３）生物素化的透明质酸多克隆抗体或单克隆抗体；　４）透明质酸结合蛋白的标记物；　５）上述标记 物所作用的化学发光底物；以及　６）洗涤液。

【技术特征摘要】
1、一种透明质酸化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括1)透明质酸校准品；2)亲和素化的固相载体；3)生物素化的透明质酸多克隆抗体或单克隆抗体；4)透明质酸结合蛋白的标记物；5)上述标记物所作用的化学发光底物；以及6)洗涤液。2、 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述亲和素化的固相载体为微 孔板、塑料珠、塑料管或^f兹性颗粒。3、 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标记物为酶或化学发光剂。4、 如权利要求3所述的标记物，其特征在于，所述酶为碱性磷酸酶或辣根过 氧化物酶；所述化学发光剂为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺。5、 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物为1,2-二氧 乙烷类衍生物、鲁米诺、异鲁米诺或过氧化氢。6、 一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤1) 以透明质酸纯品配制透明质酸校准品；2) 固相载体包被亲和素；3) 使透明质酸的多克隆抗体或...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭京胜，应希堂，宋胜利，胡国茂，郑金来，
申请(专利权)人：北京科美东雅生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]