一种检测乙肝表面抗体的磁性免疫层析试纸条及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种检测血液中乙肝表面抗体的磁性免疫层析试纸条及其制备方法。该试纸条是将包被膜、磁颗粒垫、样品垫、吸水垫依次相互交错２ｍｍ地粘贴在底板上、然后在上层覆盖透明塑料密封膜组装而成的。本发明专利技术将磁性免疫层析技术和生物素亲和素系统引入到乙肝表面抗体检测中，反应时间快，操作简便，灵敏度高，特异性好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医学检验领域，特别是涉及。
技术介绍
乙型肝炎的病原体是一种属于肝病毒科的有外壳的双链脱氧核糖核酸病毒。它的 直径为42纳米。它的脂蛋白外壳上携带乙型肝炎表面抗原HBsAg。乙型肝炎病毒简称乙肝 病毒，是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科(h印adnavividae)。 乙型肝炎病毒表面抗体一般在机体感染HBV后或接种乙肝疫苗后出现，对乙型肝 炎病毒具有保护性免疫，被称为是一种保护性抗体。 目前的HBsAb诊断技术主要包括酶联免疫试验(ELISA)、化学发光(CLIA)、免疫层 析法(胶体金或乳胶颗粒法)、PCR法，这些方法都有各自的特点和适用对象。 ELISA法是目前临床血液筛查中普遍使用的检测技术，但是ELISA试验操作程序 复杂，容易出现假阳性或假阴性结果。 CLIA与ELISA方法类似，只是灵敏度有所提高，并没有根本解决ELISA存在的问 题，并且二者都存在操作繁琐，反应时间长的问题，并都需要酶标仪或发光仪和洗板机以及 温箱等复杂设备，而且不能单人份检测，进一步限制了他们在一些基层医院、诊所的应用。 免疫层析法(Imm皿ochromatography)是九十年代兴起的一种基于免疫胶体金技 术的快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维膜的某一区带，当该干燥的 硝酸纤维素膜一端浸入样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定 有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金可使该 区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。由于结果是肉眼目视观察，容易受观察 者主观判断的影响，灵敏度低，结果准确度也不高，检测窗口期较长。 PCR方法需要很高的试验工作环境和条件(无菌操作间，超净工作台)和大量的仪 器设备(培养箱，离心机，PCR仪等)，并且操作极其复杂，需要受过严格专业训练的人员操 作，且试验周期很长，不适合用于临床检测用。 磁性免疫层析(Mgnetic ImmunoChromatographic Test，MICT)是近年来出现的一 种单人份快速定量检测技术，它是以超顺磁性颗粒(superPMPs)代替传统的标记物(胶体 金，乳胶颗粒等)来进行免疫层析，通过检测结合在超顺磁性纳米微粒上的生化物质来提 供对生物样品的定量检测数据。该技术与传统技术相比具有下述优势a.所用磁性检测仪 器采用固相元件，微型化设计自成一体，独立运行，体积小，操作简便；b.灵敏度比各类目 测快速诊断法高10-100倍；c.线形范围在4个数量级浓度范围内呈线性；d.超顺磁性纳米 微粒由聚合物包被，不会随时间而衰变。该技术继承了传统免疫层析法(胶体金，乳胶颗粒 等)简便快速，单人份操作的优点，弥补了传统免疫层析技术灵敏度低，只能定性，不能定 量的缺点，代表了当今即时检验技术发展的方向和潮流。 目前常用的标记磁颗粒为超顺磁颗粒(superPMPs)，在没有外加磁场的情况下不 具有任何磁性，只有在外加磁场作用下才会表现出磁性，商品化超顺磁颗粒都经过表面修 饰，大大方便了标记过程，标记简便，重复性好。 将生物素亲和素系统引入磁性免疫层析中，既提高了检测方法的灵敏度，又提供 了一种通用技术平台，增加了工艺的通用性，减少了系统因素的影响。 本专利技术的目的是将磁性免疫层析技术与生物素亲和素系统联合应用在乙肝表面 抗体免疫分析中。将亲和素共价偶联于超顺磁颗粒上，将生物素化HBsAg与之混合之后作 为检测流动相，将HBsAb包被于硝酸纤维素膜上制成检测线作为捕获固相，按照常规免疫 层析法的原理进行标本的检测，结合简便易行的磁性检测仪进行检测，从而使灵敏度得到 提高，既可以避免前述几种检测方法的不足，又综合了前述几种方法的优势可以单人份 检测，也可以批量检测，并且可以即时给出定量结果，测量仪器简单可靠，操作简便，方便实 用。 为达到上述的目的，本专利技术的技术方案如下本专利技术是将包被膜、结合HBsAg的磁 颗粒垫、样品垫、吸水垫、依次相互交错2mm地粘贴在底板上，然后在上层覆盖透明塑料密 封膜而制成，其中所述的包被膜上预包被有HBsAb检测线，以及生物素化牛血清白蛋白的 质控线。 选用的底板为透明塑料底板，包被膜为35mm宽度的硝酸纤维素膜，选用的吸水垫 为纤维素膜，磁颗粒垫为玻璃纤维垫，样品垫为经过样品垫处理液预处理的纤维素膜。所 述的样品垫处理液是含有1% _5%酪蛋白(casein)和0. 1% _1%的聚乙烯醇(PVP)，以及 0. 01-0. 2%吐温-20 (Tween-20)的0. 02M，pH7. 0-7. 6的磷酸盐缓冲溶液(PBS)。检测乙肝 表面抗体的磁性免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤 A、磁颗粒的制备选用直径为100-300nm的超顺磁颗粒，使用碳二亚胺(EDC)和琥 珀酰亚胺(NHS)共价偶联的方式将亲和素标记到磁颗粒上，选用生物素进行HBsAg的标记， 将标记好的生物素化HBsAg以l : 6-1 : 12的比例(体积比)与亲和素磁颗粒混合，确保 亲和素磁颗粒过量； B、将制备好的磁颗粒使用定量喷液装置以25 iU/cm-50 iU/cm的量喷涂于磁颗 粒垫上； C、包被膜的制备使用包被缓冲液分别将HBsAg以及生物素化BSA稀释到 0. 5-2mg/m的浓度，使用定量喷液装置分别将两者以0. 5_1. Oem的间隔于硝酸纤维素膜上， 晾干后于封闭液中浸泡10分钟后于25-35t:烘干8小时，加入干燥剂封存备用； D、样品垫的处理将样品垫放入样品垫处理溶液中浸泡处理1小时后取出 25-35t:烘干8小时； E、试纸条的组装在透明塑料底板上依次相互交错2mm贴上包被膜、磁颗粒垫、样 品垫、吸水垫，然后在上层覆盖透明塑料密封膜，得到试纸板，根据要求宽度切割即得到试 纸条。所述的步骤A包括以下三步 1)亲和素磁颗粒的制备使用含有0. 1% Tween-20的50mM， pH4. 5-5. 0的醋酸
技术实现思路
钠缓冲液洗涤磁颗粒，加入EDC和NHS使二者终浓度均为20mmol，室温反应1小时，使用 含有0. 1% Tween-20的50mM， pH4. 5-5. 0的醋酸钠缓冲液充分洗涤磁颗粒后加入亲和素 使亲和素与磁颗粒的分子比例为6 : 1 (摩尔比)，室温反应2. 5小时，加入含有0. 5% BSA 的0. 02M，pH7. 0-7. 6的PBS室温封闭30分钟，洗涤磁颗粒，使用含有1% PVP， 1% Casein, 0. 5% Tween-20，5X蔗糖的50mM pH8. 2-9. 0的硼酸保存缓冲液复溶磁颗粒，4保存备用； 2)生物素化HBsAg的制备将HBsAg对0. 02M， pH7. 0-7. 6的PBS 4。C透析过夜， 调整浓度为2mg/ml，将生物素使用二甲基亚砜(DMSO)溶解，终浓度为50mM，以25 : 1的分 子比例向抗原溶液中加入所需量的生物素溶液，室温反应1小时，对0.02M PBS 4t:透析过 夜，加入等体积甘油后-2(TC保存备用； 3)生物素化HBsAg与亲和素磁颗粒的混合，以0. 5 y 1/mg磁颗粒的量向亲和素磁 颗粒溶液中加入生物素化HBsAg，充分混匀后使用保存缓冲液以1 : 6-1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测乙肝表面抗体的磁性免疫层析试纸条，其特征在于：该试纸条是将包被膜、磁颗粒垫、样品垫、吸水垫依次相互交错２ｍｍ地粘贴在底板上，然后在上层覆盖透明塑料密封膜组装而成。

【技术特征摘要】
一种检测乙肝表面抗体的磁性免疫层析试纸条，其特征在于该试纸条是将包被膜、磁颗粒垫、样品垫、吸水垫依次相互交错2mm地粘贴在底板上，然后在上层覆盖透明塑料密封膜组装而成。2. 根据权利要求1所述的检测乙肝表面抗体的磁性免疫层析试纸条，其特征在于所 述的底板为透明塑料底板，包被膜为35mm宽度的硝酸纤维素膜，选用的吸水垫为纤维素 膜，磁颗粒垫为玻璃纤维垫，样品垫为经过样品垫处理液预处理的纤维素膜。3. 根据权利要求1所述的检测乙肝表面抗体的磁性免疫层析试纸条，其特征在于所 述的包被膜制备是使用0. 02mM pH7. 0_7. 6的PBS分别将乙肝表面抗原以及生物素化牛血 清白蛋白稀释到O. 5-2mg/ml的浓度，使用定量喷液装置分别将二者以0. 5_1. Ocm的间隔喷 印于硝酸纤维素膜上，晾干后于封闭液中浸泡10分钟后于25-35t:烘干8小时，加入干燥剂 封存备用。4. 根据权利要求1所述的检测乙肝表面抗体的磁性免疫层析试纸条，其特征在于所 述的包被膜上预包被有乙肝表面抗体检测线和质控线。5. 根据权利要求1所述的检测乙肝表面抗体的磁性免疫层析试纸条，其特征在于所 述的磁颗粒垫制备是选用合适的磁颗粒，使用碳二亚...

【专利技术属性】
技术研发人员：任超，应希堂，胡国茂，郑金来，唐宝军，于尚永，
申请(专利权)人：北京科美东雅生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]