甲型肝炎病毒抗原检测方法技术

本发明专利技术提供一种甲型肝炎病毒抗原检测方法。即采用长臂生物素标记ＨＡＶ－ＩｇＧ，以辣根过氧化物酶标记链霉亲和素作放大系统，对甲型肝炎病毒抗原进行检测时，由于长臂生物素比一般生物素有更长的间臂，能减少空间位阻，使几个生物素化分子能同时与一个亲和素复合物结合，加之长臂生物素为水溶性生物素，直接标记抗甲型肝炎病毒抗体可减少免疫检测中的步骤，缩短检测时间，即由通常的２天缩短为全程检测只需３．５小时，并可通过降低交叉反应而降低背景，提高检测灵敏度；另外，由于辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素与亲和素不同，其分子量大约为６００００，不含碳水化合物，非特异性结合较亲和素低，所以具有提高灵敏度及特异性的效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及甲型肝炎病毒(HAV)抗原的检测方法，属于生物学

技术介绍
在甲型肝炎减毒活疫苗、甲型肝炎灭活疫苗及相关病毒的研究工作中，均需进行甲 型肝炎病毒抗原的检测，并且由于甲型肝炎病毒HAV不能产生细胞病变(CPE)，所以在 病毒感染性滴度检测时，待检测病毒在细胞上增殖完成后，必须用物理或化学方法使病 毒释放，再用相关方法进行甲型肝炎病毒抗原(HAAg)检测。目前市面上并没有专门的 甲型肝炎病毒抗原检测试剂盒出售，对抗原的检测均由各生产厂家或各科研机构根据自 身需要使用不同的方法。根据文献检索，目前的甲型肝炎病毒抗原检测法有逆转录聚 合酶链反应(RT-PCR )法，固相杂交酶联显色法(RT-PCR- ELISA)，使用单克隆抗体 的双抗体夹心法，将甲型肝炎病毒IgM抗体诊断试剂盒改良后用于甲型肝炎病毒抗原检 测的间接法(ELISA)，生物素一亲和素一生物素标记辣根过氧化物酶复合物法(ABPC 法)。RT-PCR、 RT-PCR-ELISA法检测虽然检测灵敏度好，但需要专门的仪器设备，检测 成本较高，且特异性受到诸多因素的影响；双抗体夹心法(ELISA)操作方便，但需要 用不同株单克隆抗体分别包被和标记，而单克隆抗体筛选制备不易，普通试验室很难建 立；将甲型肝炎病毒IgM抗体诊断试剂盒改良后用于甲型肝炎病毒抗原检测的间接法 (ELISA)，则不是专门针对甲型肝炎病毒抗原的检测方法，灵敏度不高，检测时间相 对较长，检测步骤多，影响因素也多。而有报道的生物素一亲和素一生物素化辣根过氧 化物酶法，虽然使用了生物素来标记抗体，但其使用的是普通脂溶性生物素，需要用有 机溶剂溶解后才能用于标记，且其使用亲和素结合的生物素化辣根酶复合物作为酶放大 系统，复合物的浓度配比麻烦，步骤多，检测时间长。
技术实现思路
针对甲型肝炎病毒抗原检测存在的上述现状，以及甲型肝炎疫苗生产检定中要对甲 型肝炎病毒抗原进行大量检测的情况，本专利技术利用长臂生物素标记HAV-IgG，以辣根过氧化物酶标记链霉亲和素作放大系统，提供一种特异性高、灵敏度高、使用方便、用途 广泛的，应用于甲型肝炎疫苗生产及质量检定，获得了较好 的效果，本方法也可应用于甲型肝炎病毒的其他科研工作及临床检验。本专利技术通过下列技术方案完成 一种，其特征在于经过 下列步骤A、 按50 150W/孔的量，将待检甲型肝炎病毒抗原、抗原阳性对照和抗原阴性对照分别加入酶标板的孔中，并留空白调零孔，放入湿盒中，于37。C保温1 3小时后， 洗板3 5次；B、 按50 150l4/孔的量，在A步骤的酶标板的各孔中，加入稀释度为1: 500 3000 的长臂生物素标记HAV抗体使用液，放入湿盒中，于37'C保温0.5 1小时后洗板3 5 次；C、 按50 150W/孔的量，在B步骤的酶标板的各孔中，加入稀释度为1:2000 10000 的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素使用液，放入湿盒中，于37t:保温0.5 l小时后 洗板3 5次；D、 在C步骤的酶标板的各孔中，分别加入TMB显色液A和B各50ri/ L，混匀， 放入湿盒中，37。C保温10 15分钟；E、 在D步骤的酶标板的各孔中，按50 100[4 /孔的量加入终止液后置于酶标仪上， 在450nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度A值，即得检测结果。根据检测结果进行下列判定阳性对照平均A值-阴性对照平均A值》0.4时，则试验成立，反之应重试。Cutoff值4月性对照的平均A值X2. 1 (阴性对照的平均A值大于0.05，按实际值 计算；若阴性对照的平均A值小于0.05时，按0.05计算)。样品A值^Cutoff值，该样品孔判定为HAV阳性，样品A值〈Cutoff值，该样品 孔判定为HAV阴性。所述B步骤的长臂生物素标记HAV抗体经下列方法制备a、按长臂生物素甲型肝炎病毒抗体=1: 5 20克分子比的比例，将市购的长臂 生物素用注射用水溶解后，与甲型肝炎病毒抗体混合，得混合体，于室温下放置0.5 1. 0小时，或2 8X:温度下放置1 3小时；b、用磷酸盐缓冲液于2 8。C温度下透析上述a步骤的混合体并过夜，加等体积甘 油混匀，得长臂生物素标记HAV抗体，-2(TC以下保存备用。所述C步骤的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素为市购产品。 所述酶标板预先经过下列方法制备1 )酶标板包被:将纯化的HAV-IgG用碳酸盐缓冲液稀释至5-20tig/ml ，按50 15(￥1/ 孔的量加入到聚苯乙烯板中，2 8'C过夜，洗板3 5次；2)酶标板封闭按150 250W/孔的量加入封闭液，2 8。C过夜，对酶标板进行封 闭，洗板3 5次，晾干，冰箱保存备用。所述洗板用PBS洗液在洗板机上洗板或者手工洗板。所述磷酸盐缓冲液PBS、 PBS洗液、碳酸盐缓冲液、终止液、TMB显色液A和B、 封闭液均为现有技术的常规用液。本专利技术具有下列优点和效果采用上述方案，即采用长臂生物素标记HAV-IgG，以 辣根过氧化物酶标记链霉亲和素作放大系统，对甲型肝炎病毒抗原进行检测时，由于 长臂生物素比一般生物素有更长的间臂，能减少空间位阻，使几个生物素化分子能同 时与一个亲和素复合物结合，加之长臂生物素为水溶性生物素，直接标记抗甲型肝炎 病毒抗体可减少免疫检测中的步骤，縮短检测时间，即由通常的2天縮短为全程检测 只需3.5小时，并可通过降低交叉反应而降低背景，提高检测灵敏度；另外，由于辣 根过氧化物酶标记的链霉亲和素与亲和素不同，其分子量大约为60000,不含碳水化合 物，非特异性结合较亲和素低，所以具有提高灵敏度及特异性的效果。本专利技术所建立 的检测方法是一种特异性好、灵敏度高、方便快捷的。 具体实施例方式下面通过实施例对本专利技术做进一步描述。 实施例一、抗HAV血清的制备1) 用一次性注射器吸取lml组织培养的HAV抗原(520EU/ml)，排净空气后对猴或 其它适宜动物进行免疫注射；2) 在2、 3、 4周采血，并用甲型肝炎病毒抗体诊断试剂盒进行HAV抗体效价检测。 效价低于1:4000时，须进行加强免疫；3) 当抗-HAV的效价达1:4000以上时，即可通过颈动脉采血，分离血清，-2(TC以 下保存待用。二、 HAV-IgG分离纯化1)取市购蛋白A或蛋白A/G亲和层析柱，室温放置平衡30分钟，用5倍柱体积的平衡液对层析柱进行平衡；2) 将待纯化的上述一步骤3)的血清与常规平衡液按1:1的体积比混合后上样，用 IO倍柱体积的平衡液洗脱杂蛋白，留下目的蛋白；3) 用IO倍柱体积的洗脱液将目的蛋白从亲和柱上洗脱下来，收集洗脱峰，用磷酸盐缓冲液PBS透析过夜；4) 用lowry法测定蛋白含量，-20。C以下保存待用。三、 长臂生物素标记HAV抗体的制备1) 按长臂生物素甲型肝炎病毒抗体=1:10克分子比的比例，将市购的长臂生物 素用注射用水溶解后，与甲型肝炎病毒抗体混合，得混合体，于室温下放置0.5小时；2) 用磷酸盐缓冲液PBS于5。C温度下透析上述a步骤的混合体并过夜，加等体积甘 油混匀，得长臂生物素标记HAV抗体，-2(TC以下保存备用。四、 甲型肝炎病毒抗原的检测1) 酶标检测板包被将纯化的HAV-IgG用碳酸盐缓冲液稀释至lCmg/ml，按100W本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甲型肝炎病毒抗原检测方法，其特征在于经过下列步骤：　Ａ、按５０～１５０μｌ／孔的量，将待检甲型肝炎病毒抗原、抗原阳性对照和抗原阴性对照分别加入酶标板的孔中，并留空白调零孔，放入湿盒中，于３７℃保温１～３小时后，洗板３～５次；　 　Ｂ、按５０～１５０μｌ／孔的量，在Ａ步骤的酶标板的各孔中，加入稀释度为１∶５００～３０００的长臂生物素标记ＨＡＶ抗体使用液，放入湿盒中，于３７℃保温０．５～１小时后洗板３～５次；　Ｃ、按５０～１５０μｌ／孔的量，在Ｂ步骤的酶标板的各 孔中，加入稀释度为１∶２０００～１００００的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素使用液，放入湿盒中，于３７℃保温０．５～１小时后洗板３～５次；　Ｄ、在Ｃ步骤的酶标板的各孔中，分别加入ＴＭＢ显色液Ａ和Ｂ各５０μｌ／孔，混匀，放入湿盒中，３７℃ 保温１０～１５分钟；　Ｅ、在Ｄ步骤的酶标板的各孔中，按５０～１００μｌ／孔的量加入终止液后置于酶标仪上，在４５０ｎｍ波长下，用空白孔调零后检测吸光度Ａ值，即得检测结果。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：龙润乡，谢忠平，李华，宋霞，陈洪波，洪超，白惠珠，杨蓉，黄铠，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]