甲型肝炎病毒重组抗原，其中它们是从含有基于ＨＡＶ基因组的修饰片段的嵌合ＨＡＶ基因（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３）的基因构建体转化的植物细胞中获得的。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生物技术分支和更具体地说涉及重组蛋白在转基因植物细胞中的表达和这些植物作为抗原疫苗的用途。尤其是，它显示了从古巴分离的M2菌株的HAV基因组的修饰片段表达得到的转基因植物中获得的甲型肝炎病毒的重组抗原。也证明了这些抗原以不同方式接种后在动物中发展免疫应答的有用性。
技术介绍
HAV的基因组是具有正极性的简单菌种RNA。它具有大约7.5kb，编码253kDa的多蛋白(polyprotein)(Cohen等，Journal of Virology(1987)，613035-3039)。该多蛋白遭受翻译和翻译后加工，产生结构成熟的蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4和2A)和没有结构蛋白(2B、2C、3A、3B、3C和3D)。该病毒多蛋白P3结构域中存在的蛋白酶3C(Pro3C)是参与HAV多蛋白切割的蛋白酶(Martin等，J Virol.(1999)，73(8)6220-7)，允许中间体P1-2A、2BC和P3的释放，随后加工它们。因此，对于被膜的充分形成和对于HAV复制，有必要发生HAV多蛋白的差异蛋白水解加工。在P3区加工期间，仅仅3C/3D位点被有效切割。在3A/3B和/或3B/3C位点有延迟的加工，允许中间多肽3ABC蓄积(Kusov等，Journal of Virology(1999)，739867-9878)，其切割多肽P1-2A具有与蛋白酶3C相似的效率。这个步骤促进五聚体形成效率更高。特征形式的病毒来自病毒蛋白的统一，其三维构型对于保护性免疫应答的产生很重要。HAV的病毒粒子显示中和的免疫优势抗原位点，其在从不同地理区域分离的HAV菌种中严格保守。排列了五个构象性表位，五聚体装配后产生的五聚体中它们中的三个和两个其它的形成被膜。人们认为这些最新的表位是由于在五聚体装配期间它们中存在的抗原位点的构象变化或由于表位片段并列而形成的。五聚体以及病毒颗粒都诱导中和抗体，因此它们可以对疫苗开发有用(Stapleton等，Journal of Virology(1993)，671080-1085)。使用含有HAV完全开放读框的重组杆状病毒，HAV的巨大多蛋白被表达。在昆虫细胞中加工的其它中间蛋白也被表达(Stapleton等，The Journal ofInfectious Diseases(1995)，1719-14)。此外，构建在哺乳动物细胞中表达相同HAV多蛋白的重组牛痘病毒。这些基因构建体感染的细胞的提取物显示产生类似于HAV衣壳的衣壳的多蛋白翻译后加工(Winokur等，Journal of Virology(1994)，655029-5036)。有描述在杆状病毒系统和牛痘中表达的抗HAV重组疫苗变体的专利，如Winokur等专利申请WO9301279公开，1993年1月21日；专利US5294548(McLinden等，1994年3月)；专利申请WO09844122公开(Probst，2002年8月27日)；专利申请WO9111460的公开和专利US5605692(Thomas等，1997年2月25日)，其中开放读框(ORF)的序列用于免疫原性衣壳和五聚体的制备，并保护了获得HAV衣壳的方法，顺式和反式方向表达结构区和P3区的方法以及双顺反子构建体。转基因植物作为生物反应器。80年代初期产生了起源于根杆菌属根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)基因转移的第一株转基因植物(Zambryski等，EMBO J.1983，22143-2150)。这个技术起初被用作获得对致病微生物有抗性(Powe11等，Science 1986，232738-743)、对昆虫有抗性(Vaeck等，Nature 1987，32833-37)和对除草剂有抗性(Of Block等，1987，EMBO J.62513-2518)的方法。但是植物细胞正确装配结构复杂性高的外来蛋白的能力的证明迅速表明其作为逐步提高工业和生物制药行业经济制备重组蛋白的新策略的价值(Barta等，Plant Mol.Biol 1986，6347-357；Cramer等，Ann.N And Acad.Sci.1996，79262-71；Staub等，Nature Biotechn.2001.18333-338)。1992年，引入了与亚单位疫苗的制备相关的新概念。它来自转基因植物可以表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的证明。基于这些发现，人们认为植物可能用来在可食用产物中产生疫苗候选物和仅由消费这些产物产生获得免疫。通过这些事实，证明了“可食用疫苗”出现(Arntzen等，Plants.Vaccine 1994，94339-344)。后来证明了用含有HBsAg的转基因马铃薯喂养的小鼠显示出类似于用腹膜内方法施用单独剂量的商品化疫苗时获得的初次免疫应答。这些结果表明抗原在可食用植物组织中的表达可以认为是免疫的新途径(Richter等，Nature Biotechnology 2000，181167-1171)。有几个专利描述了植物用于表达疫苗的用途，如，专利US5484719(Lam等，1996年1月16日)；专利US5612487(Lam等，1996年1月16日)；专利US5914123、专利US5612487的分案和专利申请PCT/US94/02332的部分继续申请(Arntzen等，1999年6月22日)；专利US6136320(Arntzen等，1999年6月22日)；专利申请WO9612801的出版物(Arntzen等，2002年5月28日)和专利申请US2002006411(Lam等，2002年6月4日)。以前提及的文件描述了植物作为疫苗的用途，以及HBsAg在植物中表达和在一些情况下，他们使用术语“病毒性肝炎”来指乙型肝炎病毒(VHB)。VHB明显不同于甲型肝炎病毒，具有差异很大的特征，因此从分类学观点来看，它们属于不同的种类。为了获得能够产生免疫重要反应的HAV重组蛋白，有必要表达病毒基因组的几个蛋白，然后完成这种颗粒形成五聚体或空衣壳。仅仅在作为牛痘和杆状病毒的真核系统中完成免疫原性颗粒的加工和形成，但在简单系统如酵母中没有。在转基因植物中，尚未表达HAV的复杂抗原。在VHB的情况下，该抗原仅仅由在简单真核系统如酵母中有效成微粒的一个蛋白形成。由于以前揭露的论据，我们相信HBsAg表达不包括HAV五聚体或空衣壳在植物中的表达。在其它专利申请中具体描述了不同病毒抗原的表达，如Sohn等2001年8月23日的专利申请WO0161022中的人乳头瘤病毒抗原；Zhong等2001年10月31日的CN1319670中的口蹄疫发热病毒的抗原；Reads等2001年8月16日的专利申请WO0159070中的轮状病毒和Shaehar等2001年12月27日的专利申请WO0197839中的gumboro病毒。在植物中制备重组蛋白为产生在临床医学中具有重要性的药物化合物或疫苗提供了很多潜在优点。首先，植物系统比发酵系统或生物反应器中使用的工业基础设施更经济。其次，已经可利用收获和试图将植物及其产物发展为工业规模的技术。第三，当含有重组蛋白的植物用作食物(如在可食用疫苗的情况下)时，可以消除本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
【专利技术属性】
技术研发人员：A·洛佩兹奎萨达，B·戈扎乐兹拜迪罗，G·赛尔曼赫赛恩索萨，A·赫南德兹维拉斯奎兹，J·里奥斯巴卡劳，Y·罗萨保艾勇，M·皮勒兹玛缇内兹，L·罗德里盖兹雷，R·加西亚冈萨雷兹，
申请(专利权)人：遗传工程与生物技术中心，
类型：发明
国别省市：
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