本发明专利技术涉及一种血清3型鸭甲型肝炎(DHAV-3)活疫苗及其制备方法。目前血清3型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)一般只能通过鸭胚进行分离和培养，这对于该病毒的研究和血清3型鸭肝炎活疫苗的研制造成很大的障碍。本发明专利技术采用鸡胚卵黄囊接种途径，由患鸭肝炎病鸭肝脏组织分离获得血清3型鸭甲型肝炎病毒，并通过鸡胚连续传代培育得到一株致弱毒株HuB60株(CGMCC No.10307)，该致弱毒株可用于制备血清3型鸭甲型肝炎(DHAV-3)活疫苗，也可以与血清1型鸭甲型肝炎弱毒株(如A66株)以适易比例混合制备鸭甲型肝炎二价活疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种血清3型鸭甲型肝炎活疫苗（DHAV-3)及其制备方法，属于兽用生 物制品领域。
技术介绍
鸭甲型肝炎病毒（duck hepatitis A virus, DHAV)属微RNA病毒科成员（陆承 平.兽医微生物学.（第五版）北京：中国农业出版社，2012, 460-466.)，是引致雏鸭肝炎 的最重要病原，主要感染4周龄以下的雏鸭发生以肝脏出血为特征的急性肝炎，发病急、传 播快、发病率和死亡率可达90%以上。由DHAV引起的鸭肝炎自上世纪五十年代在美国被 发现以后，迅速在世界养鸭地区爆发和蔓延，我国黄均建（黄均建.小鸭病毒性肝炎研宄， 上海农业科学院畜牧兽医研宄所单行本，1963.) 1963年首次报道了上海地区鸭场爆发此 病，王平等（王平等.北京小鸭病毒性肝炎的研宄.北京大学学报（自然科学版），1980， I :55) 1980年首先在北京地区发病鸭场分离到病毒，之后我国养鸭地区均有本病的发生和 流行。随着近几年来鸭肝炎弱毒活疫苗和高免卵黄抗体的研制成功及临床应用，使本病在 很大程度上得到很好的控制。 1992年 Sandhu等（Sandhu，T. S.，B. W. Calnek，and L. Zeman. 1992. Pathologic and serologic characterization of a variant of duck hepatitis type I virus. Avian Dis 36:932-936.)报道鸭肝炎病毒发生变异现象，2002年苏敬良等（苏敬良等.新型鸭 肝炎病毒的分离及初步鉴定.中国兽医科技，2002, 1:15-16.)报道北京和广西等地区免 疫过鸭肝炎疫苗或注射过鸭肝炎高免卵黄抗体的鸭群仍然发生鸭肝炎，并且证明分离到的 鸭肝炎病毒与经典的鸭肝炎病毒无血清学交叉反应，故暂称新型鸭肝炎病毒。2007年，台 湾学者 Tseng (Tseng C. H.，Tsai H. J. , Molecular characterization of a new serotype of duck hepatitis virus. Virus Res, 2007, 126:19-31.)和韩国学者Kim(Kim M.C·，Kwon Y. K. ,Joh S.J. , et al. Recent Korean isolates of duck hepatitis virus revealed the presence of a new geno-and serotype when compared to duck hepatitis virus typel type strains. Arch Virol. 2007, I 52:2059-2072.)分别报道分离到不同于经典的鸭肝炎 病毒的新型鸭肝炎病毒，通过分子生物学和血清学鉴定，表明台湾和韩国分离的新型鸭肝 炎病毒均属DHAV，但它们之间也存在着明显的血清学差异，所以现在已明确将DHAV分为3 个血清型 ，并将经典的鸭肝炎病毒、台湾新型鸭肝炎病毒和韩国新型鸭肝炎病毒分别归 属到血清1型鸭甲型肝炎病毒（DHAV-I)、血清2型鸭甲型肝炎病毒（DHAV-2)和血清3型鸭 甲型肝炎病毒（DHAV-3)之中。通过分子生物学鉴定和血清学试验证实，我国大陆自2002 年以来分离鉴定的所有新型鸭肝炎病毒株与韩国新型鸭肝炎病毒高度同源，均为血清3型 鸭甲型肝炎病毒（DHAV-3)。 众所周知，我国是养鸭大国，目前鸭的年饲养量已达40亿只，占全世界鸭饲养总 量的70%以上，鸭肝炎一直是我国养鸭生产的头号疫病，近年来随着血清1型鸭甲型肝炎 活疫苗和高免卵黄抗体的推广应用，使血清1型鸭甲型肝炎得到有效控制，但近十年来由 于新出现血清3型鸭甲型肝炎在我国养鸭地区爆发和迅速蔓延，又成为制约我国养鸭生产 新的严峻问题。因此，血清3型鸭甲型肝炎病毒（DHAV-3)弱毒株的培育和活疫苗的研制， 以及针血清1型和血清3型鸭甲型肝炎二价活疫苗的研制成为当务之急。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种血清3型鸭甲型肝炎病毒（DHAV-3)的弱毒株及其单 价活疫苗和血清1型与血清3型二价活疫苗的制备方法。 本专利技术可以通过以下技术方案实现： 1. 一种血清3型鸭甲型肝炎病毒（DHAV-3)弱毒HuB60株，该毒株已于2015年01 月06日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄所中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No. 10307。 2.如权利要求1所述血清3型鸭甲型肝炎病毒（DHAV-3) HuB60株是通过鸡胚传代 培养获得的弱毒株。 3.如权利要求2所述DHAV-3的鸡胚培养方法，包括以下步骤： (1)选取经抗DHAV-I阳性血清和抗DHAV-3阳性血清在鸭胚上进行中和试验和交 叉中和试验确诊为DHAV-3的肝脏组织病料用于鸡胚培养分离病毒； (2)DHAV-3的组织病料的处理：取少许DHAV-3的肝脏组织，用灭菌生理盐水做 1:5 (W/V)左右稀释、研磨、冻融2~3次、离心，取离心上清液经0. 22 μ m滤器除菌过滤； (3)鸡胚接种分离病毒：取上述无菌滤液通过卵黄囊接种途径接种6~8日龄SPF 鸡胚，每只胚接种0. 2~0. 5ml，37°C培养，24h内死胚弃之，连续观察至120h，其间若有鸡胚 死亡，随时取出置2~8°C冰箱冷藏数小时或过夜；若无死亡，则于72~96h随机取3枚胚 置2~8°C冷藏过夜； (4)鸡胚传代接种：及时取出胚体，研磨成匀浆、离心取上清液经0. 22 μm除菌过 滤，取滤液经卵黄囊接种6~8日龄SPF鸡胚5~10枚，每只胚0. 2~0. 5ml ;盲传5~10 代，随着传代次数的增加，鸡胚死亡时间前移，鸡胚死亡率也逐渐达到100%，表明通过鸡胚 分离病毒成功，并逐渐适应鸡胚培养。 4. -种疫苗组合物，其特征在于包含活的如权利要求1所述的DHAV-3弱毒株（如 HuB60株）和兽用生物制品可接受的冻干保护剂。 5. -种疫苗组合物，其特征在于包含活的如权利要求1所述的DHAV-3弱毒株（如 HuB60株）、DHAV-I弱毒株（如A66株）和兽用生物制品可接受的冻干保护剂。 6.如权利要求3所述DHAV-I弱毒株（A66株），该毒株已于2013年08月13日送 交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所，中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No. 8020。 本专利技术的详细描述： 一、生产毒株血清3型鸭甲型肝炎病毒（DHAV-3)HuB60株的培育 ( -）病料的选择 对湖北某鸭场临床发生典型鸭肝炎症状的5日龄病死鸭，无菌操作取肝脏组织经 实验室鉴定： I. RT-PCR检测：取肝组织样品提取RNA，经PCR扩增和电泳，出现血清3型鸭甲型 肝炎病毒特异性条带； 2.病毒分离：取少许肝脏组织，用每毫升含青、链霉素各1000单位的灭菌生理盐 水做I : 10(W/V)稀释、研磨、冻融2次、3000r/min离心10min，取离心上清液经0. 22 μπι滤 器去菌过滤，取该滤液通过尿囊腔本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种血清3型鸭甲型肝炎病毒(duck hepatitis A virus,DHAV‑3)弱毒HuB60株，该毒株已于2015年01月06日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.10307。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张小飞，卢凤英，丁美娟，黄显明，李华东，
申请(专利权)人：南京天邦生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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