一种无血清Vero细胞制备轮状病毒疫苗原液的方法以及无血清轮状病毒疫苗制品技术

提供一种无血清Vero细胞制备轮状病毒疫苗原液的方法，包含以下步骤，用无血清培养基培养Vero细胞，获得无血清培养基适应细胞株；利用获得的所述无血清培养基适应细胞株，建立无血清Vero细胞种子库；利用获得的所述无血清培养基适应细胞株，建立无血清轮状病毒毒株工作种子库；使用无血清培养基复苏、培养、传代、扩增Vero细胞工作种子库细胞，作为生物反应器培养的基础细胞，细胞扩增后，应用生物反应器和微载体，使用无血清培养基，连续灌流培养高密度Vero细胞；接种轮状病毒毒株工作种子库毒种后，进行生物反应器微载体无血清培养，在病毒扩增至高峰时，收获病毒液，收获液病毒滴度，经澄清、超滤浓缩、得到无血清人用轮状病毒原液。

Method for preparing rotavirus vaccine liquid without serum Vero cell and serum free rotavirus vaccine product

To provide a method for serum free Vero cell preparation of rotavirus vaccine, which comprises the following steps, with Vero cells cultured in serum-free medium, serum-free medium to obtain cells; serum-free medium to cell lines obtained using the established serum-free Vero cell seed bank; serum-free culture cell lines obtained by matrix to the establishment of serum rotavirus strains of seed base; using serum-free medium recovered and cultured and passaged. Cell seed cell Vero based cell as bioreactor culture, cell expansion, application of biological reactor and micro carrier, without the use of serum medium, continuous perfusion culture of high density Vero cell vaccination; rotavirus strain working seed bank virus, serum free culture bioreactor in microcarrier, virus amplification At peak time, the viral fluid, the harvest virus titer, and the clarified and ultrafiltration concentrated serum were obtained.

【技术实现步骤摘要】
一种无血清Vero细胞制备轮状病毒疫苗原液的方法以及无血清轮状病毒疫苗制品
本专利技术涉及轮状病毒疫苗原液的制备方法，尤其涉及用生物反应器微载体培养无血清Vero细胞制备轮状病毒疫苗原液的方法以及无血清轮状病毒疫苗制品。
技术介绍
目前，大量生产人用轮状病毒疫苗所利用的细胞基质包括原代细胞，如小牛肾细胞；连续传代细胞，如非洲绿猴肾细胞(Vero)。Vero细胞是世界卫生组织认可的疫苗生产细胞系。与用作疫苗生产的原代细胞、二倍体细胞和其他一些传代细胞基质相比较，Vero细胞具有可连续传代、生长速度快、遗传性状稳定，恶性转化程度低、生物安全性较高、培养条件要求不苛刻、易于在生物反应器实施大规模培养等优势。作为贴壁成纤维细胞，Vero细胞对血清有依赖性，因为血清能为细胞的体外培养提供必要的生长因子，激素，细胞贴附因子和营养成分。利用牛血清作为Vero细胞培养和疫苗制备的培养基补充成分,具有诸多不利因素：血清组分的复杂性和不确定性，导致血清生产批次间的质量差异，增加了病毒疫苗生产的不稳定性和产品质量控制的难度，影响着病毒疫苗的生产工艺和疫苗质量；血清中存在病毒(如朊病毒)等病原微生物污染的潜在风险，给疫苗的使用带来了不容忽视的安全隐患。血清对病毒有一定的抑制作用，轮状病毒、甲肝病毒、水痘病毒等，需要胰酶激活才能很好感染细胞的病毒，由于血清培养基中的血清中和了胰酶，使病毒不能充分激活，从而降低了所收获病毒的滴度。由于以上情况，美国、欧盟和日本等发达国家已经全面停止在生物制药中应用血清，FDA将停止含血清细胞培养工艺生产的生物技术新药的申报受理。无血清培养已成为包括疫苗在内的生物技术药物生产的总趋势。现有的无血清培养技术多停留在方瓶、转瓶和细胞工厂(多层静止瓶)水平。而方瓶、转瓶及细胞工厂作为培养容器，存在工艺参数不容易控制，无法实现细胞的高密度培养和获得较高滴度的病毒液，产品的均一性也得不到保证。因此，开发能够大规模生产的生物反应器微载体无血清培养Vero细胞人用轮状病毒疫苗病毒原液的制备方法是十分必要的。现有技术的缺陷可归纳成如下几点。1.血清疫苗生产不稳定、质量难以控制；2.血清中潜在的病毒微生物会造成不安全的隐患；3.血清对病毒有一定的抑制作用，使用有血清培养基培养Vero细胞和制备病毒液，使病毒收获液滴度较低。特别是一些需要胰酶激活才能很好感染细胞的病毒(如轮状病毒等)，由于血清培养基中的血清中和了胰酶，使病毒不能较好地激活，从而大幅度地降低了所收获病毒液的病毒滴度。4.方瓶、转瓶及细胞工厂作为培养容器，不能很好地控制工艺参数，不利于细胞生长过程中的气体交换及营养充分供应，不能很好地控制工艺过程，无法实现细胞的高密度培养和获得较高滴度的病毒液，也难以实现产品的均一性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决上述现有技术的缺陷，提供一种生物反应器微载体无血清培养Vero细胞轮状病毒疫苗病毒原液的制备方法以及无血清轮状病毒疫苗制品，用于制备出均一性好、滴度高、无血清成分和安全性高的无血清病毒性疫苗原液，为大规模生产无血清培养生产Vero细胞基质的人用轮状病毒疫苗奠定基础。本专利技术的第一技术方案为一种生物反应器微载体培养无血清Vero细胞制备轮状病毒疫苗原液的方法，其特征在于，包含以下步骤，步骤1.用无血清培养基培养Vero细胞，获得无血清培养基适应细胞株；步骤2.利用获得的所述无血清培养基适应细胞株，建立无血清Vero细胞种子库；步骤3.利用获得的所述无血清培养基适应细胞株，建立无血清轮状病毒毒株工作种子库；步骤4.使用无血清培养基复苏、培养、传代、扩增Vero细胞工作种子库细胞，作为生物反应器培养的基础细胞，细胞扩增后，应用生物反应器和微载体，使用无血清培养基，连续灌流培养高密度Vero细胞；步骤5.接种轮状病毒毒株工作种子库毒种后，进行生物反应器微载体无血清培养，在病毒扩增至高峰时，收获病毒液，收获液病毒滴度，经澄清、超滤浓缩、灭活和纯化处理，得到无血清人用轮状病毒原液。第二技术方案基于第一技术方案，其特征在于，所述步骤2中，直接以无血清培养基复苏、培养和传代扩增所述无血清培养基适应细胞株，建立无血清Vero细胞主种子库和工作种子库。第三技术方案基于第二技术方案，其特征在于，所述步骤3中，使用无血清培养基，复苏、传代和扩增无血清Vero细胞工作种子库细胞，接种病毒性疫苗毒株，培养扩增后收获冻存，建立无血清病毒性疫苗毒株主种子库，再以无血清病毒性疫苗毒株主种子库毒种接种无血清Vero细胞工作种子库细胞，培养扩增后收获冻存，建立无血清病毒性疫苗毒株工作种子库。第四技术方案基于第三技术方案，其特征在于，所述步骤4中，使用无血清培养基，复苏、传代和扩增所述无血清Vero细胞工作种子库细胞，作为生物反应器培养的基础细胞，称取适量微载体，加入无血清培养基平衡过夜，将收获的细胞转入到细胞接种瓶中，无菌连接细胞接种瓶和生物反应器，使用正压将细胞接种到罐内，补充无血清培养液至工作体积，调整生物反应器培养参数，细胞接种一定时间后，调整搅拌桨转速，开始灌流细胞扩增培养基，在细胞数量达到规定量时，做好接种病毒的准备。第五技术方案基于第四技术方案，其特征在于，所述步骤5中，在微载体上满球率达80％以上，换液，取样进行细胞计数，按MOI0.001-0.01加入无血清培养基，进行载体上细胞与病毒的吸附，完成细胞对病毒的吸附之后，在病毒高峰到来时，收获病毒液。第六技术方案基于第三技术方案，其特征在于，所述步骤3中，在病毒液中加入含10-40μg/mL胰蛋白酶的激活剂，37℃水浴作用60min，取长满单层的状态良好的Vero细胞，将激活后的病毒液株以MOI0.005接种Vero细胞，置于37℃恒温室吸附60min，补加无血清病毒维持液液至30mL，轻轻混匀，将细胞瓶继续置于37℃恒温室培养，于接种病毒规定时间后，病毒高峰期收获病毒并取样，细胞瓶及取样管密封置于-20℃，连续冻融三次，置于-80℃冻存。第七技术方案基于第四技术方案，其特征在于，所述步骤4中，使用无血清培养基，复苏、传代和扩增无血清Vero细胞工作种子库细胞，根据生物反应器工作体积，按载体投入量8-18g/L计算，称取适量微载体，用0.05mol/LPBS(pH7.2)浸泡，换液3～4次，用PBS于4℃浸泡过夜，经高压灭菌后，载体以加液泵导入罐体内，加入无血清培养基，转速50转/分钟，温度37℃，PH7.2-7.6，DO20-60，平衡过夜，将收获的细胞转入到细胞接种瓶中，控制细胞悬液的体积，取样进行细胞计数，保证接种后的细胞密度不低于1.0-1.5×106个/ml，无菌连接细胞接种瓶和生物反应罐，使用正压将细胞接种到罐内，补充无血清培养液至工作体积，整生物反应培养参数：温度为37℃，DO20-60，通气量为0.5LPM，搅拌桨转速25-35转/分钟，温度37℃，PH7.2-7.6，细胞接种24小时后，调整搅拌桨转速至50-60转/分钟，开始灌流细胞扩增培养基，第一至三天为0.5-1个罐体积/灌流量，第二天为2.5个罐第三天至第七天为1-3个罐体积/灌流量，每天取样镜下观察细胞生长状态，同时结合氧气消耗量和PH变化情况调整灌流量，当第6-7天细胞数量达到0.9-1.1×10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种无血清Vero细胞制备轮状病毒疫苗原液的方法，其特征在于，包含以下步骤，步骤1.用无血清培养基培养Vero细胞，获得无血清培养基适应细胞株；步骤2.利用获得的所述无血清培养基适应细胞株，建立无血清Vero细胞种子库；步骤3.利用获得的所述无血清培养基适应细胞株，建立无血清轮状病毒毒株工作种子库；步骤4.使用无血清培养基复苏、培养、传代、扩增Vero细胞工作种子库细胞，作为生物反应器培养的基础细胞，细胞扩增后，应用生物反应器和微载体，使用无血清培养基，连续灌流培养高密度Vero细胞；步骤5.接种轮状病毒毒株工作种子库毒种后，进行生物反应器微载体无血清培养，在病毒扩增至高峰时，收获病毒液，收获液病毒滴度，经澄清、超滤浓缩、灭活和纯化处理，得到无血清人用轮状病毒原液。

【技术特征摘要】
1.一种无血清Vero细胞制备轮状病毒疫苗原液的方法，其特征在于，包含以下步骤，步骤1.用无血清培养基培养Vero细胞，获得无血清培养基适应细胞株；步骤2.利用获得的所述无血清培养基适应细胞株，建立无血清Vero细胞种子库；步骤3.利用获得的所述无血清培养基适应细胞株，建立无血清轮状病毒毒株工作种子库；步骤4.使用无血清培养基复苏、培养、传代、扩增Vero细胞工作种子库细胞，作为生物反应器培养的基础细胞，细胞扩增后，应用生物反应器和微载体，使用无血清培养基，连续灌流培养高密度Vero细胞；步骤5.接种轮状病毒毒株工作种子库毒种后，进行生物反应器微载体无血清培养，在病毒扩增至高峰时，收获病毒液，收获液病毒滴度，经澄清、超滤浓缩、灭活和纯化处理，得到无血清人用轮状病毒原液。2.根据权利要求1所述的一种无血清Vero细胞制备轮状病毒原液的方法，其特征在于，所述步骤2中，直接以无血清培养基复苏、培养和传代扩增所述无血清培养基适应细胞株，建立无血清Vero细胞主种子库和工作种子库。3.根据权利要求2所述的一种无血清Vero细胞制备轮状病毒原液的方法，其特征在于，所述步骤3中，使用无血清培养基，复苏、传代和扩增无血清Vero细胞工作种子库细胞，接种病毒性疫苗毒株，培养扩增后收获冻存，建立无血清病毒性疫苗毒株主种子库，再以无血清病毒性疫苗毒株主种子库毒种接种无血清Vero细胞工作种子库细胞，培养扩增后收获冻存，建立无血清病毒性疫苗毒株工作种子库。4.根据权利要求3所述的一种无血清Vero细胞制备轮状病毒原液的方法，其特征在于，所述步骤4中，使用无血清培养基，复苏、传代和扩增所述无血清Vero细胞工作种子库细胞，作为生物反应器培养的基础细胞，称取适量微载体，加入无血清培养基平衡过夜，将收获的细胞转入到细胞接种瓶中，无菌连接细胞接种瓶和生物反应器，使用正压将细胞接种到罐内，补充无血清培养液至工作体积，调整生物反应器培养参数，细胞接种一定时间后，调整搅拌桨转速，开始灌流细胞扩增培养基，在细胞数量达到规定量时，做好接种病毒的准备。5.根据权利要求4所述的一种无血清Vero细胞制备轮状病毒原液的方法，其特征在于，所述步骤5中，在微载体上满球率达80％以上，换液，取样进行细胞计数，按MOI0.001-0.01加入无血清培养基，进行载体上细胞与病毒的吸附，完成细胞对病毒的吸附之后，在病毒高峰到来时，收获病毒液。6.根据权利要求3所述的一种无血清Vero细胞制备轮状病毒原液的方法，其特征在于，所述步骤3中，在病毒液中加入含10-40μg/mL胰蛋白酶的激活剂，37℃水浴作用60min，取长满单层的状态良好的Vero细胞，将激活后的病毒液株以MOI0.005...

【专利技术属性】
技术研发人员：付作申，安有才，张玉辉，于海龙，刘鹏，徐奇，刘冰冰，陈辉黎，陈晓芬，冷文娜，张慧萍，安蕊，
申请(专利权)人：江苏中慧元通生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32