一种鸡alpha干扰素及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种鸡alpha干扰素及其制备方法。本发明专利技术选择pBV220温控表达载体用于构建重组大肠杆菌chIFN‑α‑pBV220株，保藏编码为CGMCC No.13431。用该重组菌株作为生产菌株通过调节培养温度成功诱导并大量表达具有生物活性的chIFN‑α蛋白。该重组菌株表达的具有生物活性的chIFN‑α蛋白不仅能够提高大规模工业生产的效益也为鸡病毒性疾病的治疗和预防提供一种新产品。

Chicken breeder alpha interferon and preparation method thereof

The invention relates to a chicken breeder alpha interferon and a preparation method thereof. The invention selects pBV220 temperature control expression vector to construct recombinant Escherichia coli chIFN alpha pBV220 strain, CGMCC No.13431 encoding for preservation. With the recombinant strain as producing strain by regulating the temperature induced expression of chIFN and protein with biological activity. The expression of the recombinant strain with the biological activity of chIFN protein can not only improve the efficiency of large-scale industrial production for the treatment and prevention of chicken viral diseases to provide a new product.

【技术实现步骤摘要】
一种鸡alpha干扰素及其制备方法
本专利技术涉及一种鸡alpha干扰素及其制备方法。属于兽用生物制品领域。
技术介绍
鸡的病毒性疾病是危害养鸡业最为严重的疾病之一。目前，我国预防和控制鸡病毒性疾病主要依靠疫苗免疫，由于疫苗免疫的血清型单一，而病毒毒株变异速度快，从而常导致疫苗免疫失败。鸡alpha干扰素(chIFN-α)作为一种多功能细胞因子，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生理功能，其不仅对鸡的病毒性疾病如新城疫、传染性法氏囊炎、传染性喉气管炎和传染性支气管炎等具有良好的治疗效果，而且能够显著提高疫苗的免疫效力。此外，干扰素相比于抗生素具有无毒副作用、无药物残留等优点，因此chIFN-α产品的研发对鸡病毒性疾病的预防和治疗具有重要的临床意义。目前chIFN-α产品的研发方法主要包括诱生剂诱导免疫细胞提取干扰素蛋白法和基因工程技术表达干扰素蛋白两种方法。诱生剂诱导免疫细胞提取干扰素蛋白法生产的干扰素产品面临两个问题：一是大量生产必须保证有足够数量的外周血白细胞，二是以病毒作为诱生剂存在潜在病毒污染的情况。此外，这种方法提取的干扰素产量有限、产物成分复杂、价格昂贵，从而限制了其在临床上的应用。以基因工程技术为依托生产的基因重组鸡干扰素产品因产物成分单一、操作简单、产量高和适应于大规模生产等特点而得到了广泛的应用。基因重组chIFN-α的表达系统根据表达宿主的不同分为原核表达系统、酵母表达系统、哺乳细胞表达系统和昆虫表达系统。其中原核表达系统相比于其他的表达系统具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化效率高、生长繁殖快、成本低廉等优点成为重组基因工程chIFN-α大规模工业生产的优选表达系统。而大肠杆菌因具有操作简单和能在廉价的培养基中迅速生长的特征，成为原核表达系统首选的表达菌株。常用于基因重组蛋白表达的大肠杆菌菌株包括DH5α、BL21和JM系列；常用的大肠杆菌表达载体有pBV220、pBV321、pET28a和pET32a等。其中pBV220表达载体属于温度敏感系统表达载体，该载体的启动子为PL和PR强启动子，该启动子受λ噬菌体CI基因负调控，当温度达到42℃时宿主菌表达目的蛋白。pET28a和pET32a表达载体的启动子为lac强启动子，该启动子受大肠杆菌lac阻遏蛋白负调控，需要在异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下表达目的蛋白。与IPTG诱导宿主菌表达目的蛋白不同，温控表达载体只需要调节温度即可实现目的蛋白的大量表达，因此其大大节省了大规模工业生产的成本。
技术实现思路
本专利技术的目的是选择pBV220温控表达载体用于构建chIFN-α-pBV220重组菌株作为生产菌株，通过调节培养温度成功诱导表达具有生物活性的chIFN-α蛋白，用于病毒性疾病的治疗和预防用药。本专利技术市基于基因重组chIFN-α蛋白研发的重要临床意义和社会价值，本研究选择pBV220载体为表达载体，以DH5α大肠杆菌为宿主菌构建chIFN-α-pBV220重组菌株并在42℃条件下诱导该菌株表达chIFN-α蛋白。细胞病变抑制试验表明该菌株诱导表达的chIFN-α蛋白能够有效抑制水泡性口炎病毒(VSV病毒)在人羊毛膜细胞(wish细胞)上增殖，说明其具有良好的生物活性。根据Reed-Muench法计算该菌株诱导的chIFN-α蛋白生物学效价为235250IU/ml。本专利技术的产品不仅能够提高大规模工业生产的效益也为鸡病毒性疾病的治疗和预防提供新的药物。本专利技术技术方案1.一种鸡alpha干扰素，其特征在于该鸡alpha干扰素是一种由pBV220温控表达载体构建的保藏编号为CGMCCNo.13431的重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株菌作为生产菌株，并通过调节培养温度成功诱导表达具有生物活性的chIFN-α蛋白。2.本专利技术所述一种鸡alpha干扰素的制备方法，其特征在于该方法为：(1)种子培养：用含氨苄青霉素的25mlSOB液体培养基培养重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株菌；(2)菌液的制备：用生产用培养基按按0.5％～1％(V/V)比例接种种子液37℃通气培养8～10小时。迅速升温至42℃，经温度诱导4～6小时后，终止培养；(3)细菌破碎：将发酵菌液连续通过高压匀质机或者超声波进行破碎；(4)包涵体的制备：破碎后的细菌经离心收集沉淀得到鸡干扰素包涵体蛋白；加入3mol/L尿素洗涤液，高速匀浆，经离心收集沉淀，再经溶解、离心收集上清液，即为粗制鸡alpha干扰素；(5)重组鸡干扰素的纯化：采用AKTApure纯化系统(GE产品)进行重组鸡干扰素的纯化；收集洗脱下来的蛋白吸收峰，即为纯化后的重组鸡干扰素蛋白。纯化后的蛋白经0.22μm过滤器过滤除菌，2～8℃贮存。本专利技术具体实施方式基于基因重组chIFN-α蛋白研发的重要临床意义和社会价值，本研究选择pBV220载体为表达载体，以DH5α大肠杆菌为宿主菌构建chIFN-α-pBV220重组菌株，保藏编号为CGMCCNo.13431，并在42℃条件下诱导该菌株表达chIFN-α蛋白。本专利技术构建的重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株菌能够诱导表达鸡干扰素蛋白，在42℃诱导条件下重组菌株在19KD处能够显现出表达目的蛋白，而空载体菌株由于没有目的基因片段，不能表达目的蛋白；未经42℃诱导表达的重组菌株在19KD处也无目的蛋白的表达。参见图1。细胞病变抑制试验表明该菌株诱导表达的chIFN-α蛋白能够有效抑制水泡性口炎病毒(VSV病毒)在人羊毛膜细胞(wish细胞)上增殖，说明其具有良好的生物活性。根据Reed-Muench法计算该菌株诱导的chIFN-α蛋白生物学效价为2～4×105IU/ml。该产品的研发不仅能够提高大规模工业生产的效益也为鸡病毒性疾病的治疗和预防提供新的药物。本专利技术鸡alpha干扰素的制备方法为：1.鸡alpha干扰素的制备本专利技术所述的该鸡alpha干扰素是本专利技术人由pBV220温控表达载体构建的保藏编号为CGMCCNo.13431的重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株菌作为生产菌株，并通过调节培养温度成功诱导表达具有生物活性的chIFN-α蛋白。其chIFN-α蛋白制备方法为：(1)生产菌种为本专利技术人由pBV220温控表达载体构建的保藏编号为CGMCCNo.13431的重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株菌作为生产菌株。(2)制备方法：1)用含氨苄青霉素的25mlSOB液体培养基培养种子。2)菌液的制备用生产用培养基按0.5％～1％(V/V)比例接种种子液，37℃通气培养8～10小时。迅速升温至42℃，经温度诱导4～6小时后，停止发酵。3)细菌破碎将发酵菌液连续通过高压匀质机或者超声波进行破碎.。4)包涵体的制备破碎后的细菌经离心收集沉淀得到鸡干扰素包涵体蛋白；加入3mol/L尿素洗涤液，高速匀浆，经离心收集沉淀，再经溶解、离心收集上清液，即为粗制鸡alpha干扰素。5)重组鸡干扰素的纯化采用AKTApure纯化系统(GE公司产品)进行重组鸡干扰素的纯化。收集洗脱下来的蛋白吸收峰，即为纯化后的重组鸡干扰素蛋白。纯化后的蛋白经0.22μm过滤器过滤除菌，2～8℃贮存。2.重组chIFN-α蛋白生物活性鉴定将Wish细胞(人羊膜细胞，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸡alpha干扰素，其特征在于该鸡alpha干扰素是一种由pBV220温控表达载体构建的保藏编号为CGMCC No.13431的重组大肠杆菌chIFN‑α‑pBV220株菌作为生产菌株，并通过调节培养温度成功诱导表达具有生物活性的鸡chIFN‑α蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种鸡alpha干扰素，其特征在于该鸡alpha干扰素是一种由pBV220温控表达载体构建的保藏编号为CGMCCNo.13431的重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株菌作为生产菌株，并通过调节培养温度成功诱导表达具有生物活性的鸡chIFN-α蛋白。2.如权利要求1所述一种鸡alpha干扰素的制备方法，其特征在于该方法为：(1)种子培养：用含氨苄青霉素的25mlSOB液体培养基培养重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株菌；(2)菌液的制备：用生产用培养基按(V/V)接种0.5～1％种子液，3...

【专利技术属性】
技术研发人员：江国托，李凤华，潘珊，徐凤平，
申请(专利权)人：大连三仪动物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21