用于表达肽和蛋白的方法技术

本发明专利技术属于分子生物学、重组肽和蛋白表达领域，且涉及包含含有T1SS转运物或其片段的核苷酸序列用于高效生产重组PeOI和PrOI的方法。所述转运物或其片段促进PeOI和PrOI作为IB的表达，可充当IB标记。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于分子生物学、重组肽和蛋白表达领域，且涉及包含含有Tl SS底物/转运 物或其片段的核苷酸序列用于高效生产目的重组肽和蛋白的方法。所述转运物或其片段促 进目的重组肽和蛋白作为包涵体(IB)的表达，可充当IB标记。
技术介绍
近年来，重组蛋白/酶的生产在工业生产过程中的用途已变得越来越重要，且可以 预期许多工业过程即将涉及重组技术。目前，生物活性肽和蛋白用作各种疾病中的治疗剂， 例如，糖尿病(胰岛素），病毒感染和白血病(干扰素），免疫系统疾病（白介素），和红血细胞 不足(红细胞生成素）。此外，各种工业应用中需求大量蛋白和肽，包括，例如，纸浆和造纸工 业，纺织业，食品行业，个人护理和化妆品工业，糖精制，废水处理，酒精饮料生产和用于生 产新药物的催化剂。 然而，重组肽和蛋白的表达仍然受限，要获得大量、高纯度且天然折叠的期望的肽 和蛋白需要付出巨大努力。通常，由于特性类似的蛋白难以区分，产品的纯化是昂贵的，特别是达到100%纯 度的最后一步，容易成倍增加费用（Hacking, A.J.( 1986)Economic aspects of biotechnology,Cambridge University Press)。 在许多情况下，表达不溶形式的蛋白或肽是有用的，尤其是当目的肽(PeOI)或蛋 白（PrOI)相当短、通常为水溶性和/或在宿主细胞内面临蛋白降解时。生产不溶形式的肽， 既便于简单回收，又保护肽不遭受蛋白降解。一种用于生产不溶形式的肽的方法，是通过在 所述融合肽中包括至少一种诱导IB形成的溶解性标记（即，包涵体（IB)标记），从而重组产 生作为不溶融合肽/蛋白的一部分的肽。典型地，融合蛋白设计为包括至少一个可裂解的肽 接头，从而使得PeOI或PrOI可随后从融合蛋白中回收。该融合蛋白可被设计为包括多个IB-标记，可裂解肽接头和编码PeOI或PrOI的区域。 促进不溶性蛋白表达且包含肽标记的融合蛋白是公知的现有技术。通常，所述嵌 合或融合蛋白的标记部分大，增加该融合蛋白的不可溶可能性。通常使用的大肽的例子包 括但不限于：氯霉素乙酰转移酶acetyltransferase(Dykes et al.，（1988) Eur .J.Biochem.，174:411)，β半乳糖苷酶（ScheIlenberger et al ·，（ 1993)Int .J.Peptide Protein Res.，41:326;Shen et al.，（1984)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 281:4627;和Kempe 6七31.，（1985)661^，39:239)，谷胱甘肽5-转移酶（1^7 6七31.，（1993)8丨。/^6(^11。1〇87， ll:64and Hancock et al.(W094/04688))，L-核酮糖激酶的N端（美国专利5206154和Lai et al ·，（1993)Antimicrob.Agents&Chemo. ,37:1614)， 菌体T4gp55蛋白protein(Gramm et al ·，（ 1994) Bio/Techno logy ,12:1017)，细菌酮类固醇异构酶蛋白（Kul iopulos et al.，（1994)J Am.Chem.Soc.ll6:4599和美国专利5648244)，泛素 （Pilon et al. ,(1997) Biotechnol .Prog.，13:374-79)，牛凝乳酉每原（Haught et al ·，（1998) Biotechnol · Bioengineer · 57: 55-61 )，和杀菌/渗透性增强蛋白（〃BPI〃 ； Better，M. D · and Gavit，P D.，美国专利6242219)。本领域中存在大量该技术的具体例子，例如参见美国专利 6037145,其中教导了一种保护已表达嵌合蛋白不受特定蛋白酶影响的标记；美国专利 5648244,其中教导了具有便于期望蛋白纯化的标记和裂解接头的融合蛋白的合成;和美国 专利5215896、5302526; 5330902;和美国专利申请公开No. 2005/221444,其中描述了包含专 门设计用于增加嵌合蛋白或肽不溶性的氨基酸组合物的融合标记。 然而，本领域中已知的方法没有提供任何解决PeOI或PrOI复性的方法。因此，本领 域中仍需要能够改进重组PeO I和PrO I生产的方法。 本专利技术人发现，包括含溶血素 A(HlyA)或脂酶A(LipA)基因片段的核酸序列的方 法，能够解决现有技术中的上述需要。两种基因均是I型分泌系统(TlSS)，其主要存在于革 兰氏阴性菌，且通过单一步骤将其同源底物从胞浆运输至细胞外介质，而无需形成周质底 物中间体。TISS家族中，Bakkes et a 1.所述的涉及HlyA作为运输底物的HlyTISS特别令人 感兴趣，因为它携带具有共有序列GGxGxDxUxU:任意氨基酸残基，U:大的疏水性氨基酸残 基）的所谓66重复序列（〇3切1&23，!1.6七31.，（1995迮1^了8丨〇(*6111228,39-44)。所述66重 复序列对Ca 2+高亲和力结合，所述结合发生于TlSS转运物分泌到Ca2+浓度高（多至mM范围） 于细胞内部的细胞外部之后。结合到GG重复序列的Ca 2+催化转运物折叠成天然活性构象， 且Ca 2+离子充当了折叠辅助细胞/分子伴侣（Jumpertz,T.et al. ,Microbiology 156， 2495-2505，doi:mic.0.038562-0)。大肠杆菌的HlyA TlSS的其他成分包括内膜蛋白 HlyB，其为ATP结合盒(ABC)转运子，外膜蛋白（OMP)TolC和内膜的膜融合蛋白（MFP)HlyD。
技术实现思路
本专利技术的第一方面中，涉及用于生产期望的重组PeOI或PrOI的方法，其中所述方 法包括：（a)将编码包含至少一个PeOI或PrOI和至少一个I型分泌系统(TlSS)的转运物或其 片段的融合蛋白的核酸分子，引入宿主细胞中，其中所述宿主细胞不表达所述TlSS的异源 ABC转运子，异源MFP和/或异源OMP; (b)在允许所述融合蛋白表达的条件下培养所述宿主细 胞，其中所述融合蛋白的表达形式为IB; (c)从所述宿主细胞分离所述重组融合蛋白；和(d) 令所述重组融合蛋白暴露在允许所述PeOI或PrOI折叠为功能性三维构象的条件下。 在多个实施例中，所述TISS转运物选自：HlyA，CyaA，EhxA，LktA，PILktA，PasA， PvxA,MmxA,LtxA,ApxIA,ApxIIA,ApxIIIA,ApxIVA,Apxl,ApxII,AqxA,VcRtxA,VvRtxA, MbxA，RTX细胞毒素，RtxLl，RtxL2，FrhA，LipA，Tl iA，PrtA，PrtSM，PrtG，PrtB，PrtC，Apr A， AprX，ZapA，ZapE，Sap ,HasA，大肠杆菌素 V ,LapA，ORF ,RzcA ,RtxA ,XF2407，XF2759 ,RzcA， RsaA，Crs，CsxA，CsxB，S本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于生产目的重组肽(PeOI)或目的蛋白(PrOI)的方法，其中所述方法包括：(a)将编码融合蛋白的核酸分子引入宿主细胞中，所述融合蛋白包含至少一个PeOI或PrOI和至少一个I型分泌系统(T1SS)转运物或其片段，其中所述宿主细胞不表达所述T1SS的异源ATP结合盒(ABC)转运子、异源膜融合蛋白(MFP)和/或异源外膜蛋白(OMP)；(b)在允许所述融合蛋白表达的条件下培养所述宿主细胞，其中所述融合蛋白的表达形式为包涵体(IB)；(c)从所述宿主细胞中分离出重组融合蛋白；和(d)令所述重组融合蛋白接触允许所述PeOI或PrOI折叠为功能性三维构象的条件。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：露兹·施密特，克里斯蒂安·施瓦兹，桑达亨德利库乔安尼斯·施密茨，
申请(专利权)人：杜塞尔多夫海因里希·海涅大学，
类型：发明
国别省市：德国;DE