本发明专利技术公开一种鲨鱼糖蛋白及其制备方法和用途，本发明专利技术所述鲨鱼糖蛋白是从鲨鱼鱼肉经组织捣碎、脱脂、酶解、再经DEAE-cellulose-52柱层析、Sephadex?G-100柱层析和反相高效液相色谱纯化，浓缩、再经冷冻干燥步骤得到鲨鱼糖蛋白。本发明专利技术的鲨鱼糖蛋白的分子量约为26.4kDa，糖和蛋白含量分别为33.65％和66.35％，含有O-糖肽键和N-糖肽键，单糖的组成包括L-岩藻糖、L-阿拉伯糖、L-半乳糖、D-葡萄糖和D-甘露糖，相应比例为1.00∶1.53∶7.27∶9.07∶2.09；蛋白质由17中氨基酸组成。本发明专利技术的鲨鱼糖蛋白在临床上可以作为一种新生血管抑制剂使用，可用于肿瘤等疾病的治疗，具有广阔的市场前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物制药工程
，尤其涉及是一种鲨鱼糖蛋白及其制备方法以及在抗肿瘤方面的应用。
技术介绍
糖蛋白(glycoprotein)是一类由糖类物质(多为寡糖)与蛋白质或多肽以共价键(O-糖苷键或N-糖苷键)连接而形成的结合蛋白，广泛地存在于动物、植物和微生物体内，是生物体内一类非常重要的功能大分子。自20世纪60年代以来，生物化学、化学和药学等领域的研究人员经过广泛和深入的研究，发现糖蛋白具有显著的药用价值和保健价值，具有抗肿瘤、提高免疫力、降血脂、抗糖尿病、抗氧化和防衰老等多种功能。目前已成功应用于临床并具有显著生物活性的药用蛋白制剂大都是糖蛋白。近年来，天然产物来源的糖蛋白，在生物化学、蛋白质工程学、临床医学、药物化学及功能食品等领域受到高度重视。特别是存在于动、植物中的具有显著生物活性的糖蛋白，在创新药物及功能性食品开发方面具有广阔的应用前景。鲨鱼肉味甘、咸，性平，归脾、肺经。具补虚、健脾、利水、祛瘀消肿之功效。主治久病体虚、脾虚浮肿和创口久不愈合等病症。目前，国内外学者对鲨鱼研究主要集中在软骨抗肿瘤活性成分(多糖、蛋白质、多肽)、鲨鱼皮胶体蛋白、鲨鱼肝脏的鱼肝油(角鲨烯)等领域。鱼肉主要作为食补材料，而其活性成分，特别是鱼肉糖蛋白的制备工艺及其作为抗肿瘤物质的应用尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是提供一种鲨鱼糖蛋白，对血管生成及肿瘤有明显的抑制作用。 本专利技术所要解决的第二个技术问题是提供一种鲨鱼糖蛋白的制备方法。本专利技术所要解决的第三个技术问题是提供一种鲨鱼糖蛋白的应用。本专利技术解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为:一种鲨鱼糖蛋白，其特征在于该鲨鱼糖蛋白的分子量为26.4Da，其中糖和蛋白含量分别为33.65%和66.35%，该鲨鱼糖蛋白中单糖的组成包括L-岩藻糖、L-阿拉伯糖、L-半乳糖、D-葡萄糖和D-甘露糖，相应比例为 1.00: 1.53: 7.27: 9.07: 2.09。作为优选，所述鲨鱼糖蛋白的分子量为26.4Da，其中糖和蛋白含量分别为33.65%和66.35%，所述鲨鱼糖蛋白中单糖的组成包括L-岩藻糖、L-阿拉伯糖、L-半乳糖、D-葡萄糖和D-甘露糖，相应比例为L 00: 1.53: 7.27: 9.07: 2.09。作为改进，所述鲨鱼糖蛋白的组分在280nm处有蛋白质特征吸收值，同时用苯酚-硫酸法检测时，在490nm有多糖特征吸光值的组分。再改进，所述鲨鱼糖蛋白的糖肽的结合方式为N-糖肽键和O-糖肽键。 最后，所述鲨鱼糖蛋白中有17种氨基酸，其中IOOg总氨基酸中含有丙酸酸10.4g，精氨酸5.9g，天冬氨酸8.3g，半胱氨酸0.1g,谷氨酸8.7g，甘氨酸15.6g，组氨酸0.2g，异亮氨酸1.2g，亮氨酸2.9g，赖氨酸2.2g，蛋氨酸0.9g，苯丙氨酸2.6g，脯氨酸9.5g，丝氨酸16.7g,苏氨酸8.9g,酪氨酸0.3g,缴氨酸5.6g。本专利技术解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为:一种鲨鱼糖蛋白的制备方法，其特征在于步骤为:I)匀浆:鲨鱼肉于80% 95(v) %乙醇溶液中匀浆2 4min，匀浆液用0.5 1.5mol/LNa0H调pH值至8.5 9.5,用双蒸水调乙醇浓度至50% 70 (V) %,于20 30°C水浴中保温20 40min后，于3000 5000r/min离心10 20min,收集上清液；加NaCl将上清液的NaCl浓度调至5% IO(Wt) %，于20 30°C水浴中10 15小时，于3000 5000r/min离心10 20min，收集沉淀；2)脱脂:将I)所得沉淀物加入乙醚处理2 3小时，过滤得沉淀物，冻干得脱脂蛋白粉末；3)酶解:将2)所得脱脂蛋白粉末按照料液比1: 40 1: 60溶于双蒸水中，用0.5 1.5mol/LHCl调pH至5.5 6.5，按照脱脂蛋白粉末0.8 1.2 (wt) %的量加入木瓜蛋白酶，于50 60°C酶解2 4小时；将所得的酶解产物先经灭酶处理，得酶解液，酶解液3000 5000r/min离心20 40min,取上清液脱盐、浓缩和冷冻干燥,得糖蛋白粗品；4)精制:将3)所得糖蛋白粗品溶于双蒸水中，经阴离子交换树脂柱层析，先用0.09 0.llmol/L NaCl 洗脱，然后用 0.45 0.55mol/L NaCl 洗脱，收集0.45 0.55mol/L NaCl洗脱组分，即得粗糖蛋白组分；将所收集的粗糖蛋白组分再上葡聚糖凝胶柱，用去离子水洗脱，收集糖蛋白组分；将凝胶色谱收集的糖蛋白组分用高效液相色谱纯化，收集洗脱峰，冷冻干燥得糖蛋白。 作为优选,所述步骤3)中的木瓜蛋白酶的酶活力> lX106U/g。作为改进，所述步骤3)中的灭酶处理为:将所得的酶解产物升温至95 100°C，并于此温度保持10 15min，再冷却至10 20°C以终止酶反应；所述步骤3)中的脱盐过程为:将酶解液制成浓度10mg/ml 20mg/ml的溶液，进行DlOl大孔树脂脱盐；脱盐后的酶解液在不高于40°C的低温下进行真空浓缩，得到浓缩酶解液于低温冻干。最后，所述步骤4)中的阴离子交换树脂为DEAE-cellulose-52，葡聚糖凝胶为Sephadex G-100 ;高效液相色谱的条件为:色谱柱为Inertsil 0DS_3C18柱,流动相为 乙腈-水，含0.1 (wt) %三氟乙酸梯度洗脱,流速为0.8 1.2mL/min。本专利技术解决上述第三个技术问题所采用的技术方案为:一种鲨鱼糖蛋白应用于抗肿瘤药物中或者作为一种新生血管抑制剂使用。与现有技术相比，本专利技术的优点在于:本专利技术以鲨鱼鱼肉为原料，利用脱脂、酶解、离子交换树脂柱层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化制备糖蛋白，不仅原料丰富，而且制备工艺简单、易操作，制得的鲨鱼糖蛋白经鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成抑制实验显示对新生血管具有显著抑制作用，且呈现量效关系，体外抗肿瘤实验显示对肿瘤细胞株P388(人白血病细胞株)、A-549(人肺腺癌)和BEL-7402 (肝癌细胞株)均显示出明显的抑制作用，并呈剂量依赖关系。本专利技术的鲨鱼糖蛋白在临床上可以作为一种新生血管抑制剂使用，可用于肿瘤等疾病的治疗，具有广阔的市场前景。附图说明图1鲨鱼脱脂蛋白酶解物在DEAE-Cellulose-52层析柱上的洗脱曲线(0.5mol/LNaCl洗脱组分);图2粗糖蛋白组分在Sephadex G-100层析柱上的洗脱曲线；图3糖蛋白组分在RP-HPLC上的洗脱曲线；图4鲨鱼糖蛋白FT-1R图；图5糖蛋白的SDS-PAGE图；其中第一栏:鲨鱼糖蛋白；第二栏:由PNGase F酶解后的鲨鱼糖蛋白降解物；图6碱处理前后鲨鱼糖蛋白的UV图谱；图7鲨鱼糖蛋白的温度降解曲线；图8鲨鱼糖蛋白抑制CAM血管生成的测定的结果，其PBS为阴性对照，CS为阳性对照。具体实施例方式以下结合附图实施例 对本专利技术作进一步详细描述。本专利技术所用的仪器设备:Agilent 1200高效液相色谱(美国Agilent公司)Mill1-Q system(美国 Millipore 公司)DEAE-cellulose-52 和 Sephadex G-100 柱层析设备(瑞典 Pha本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鲨鱼糖蛋白，其特征在于该鲨鱼糖蛋白的分子量为26.4Da，其中糖和蛋白含量分别为33.65％和66.35％，该鲨鱼糖蛋白中单糖的组成包括L?岩藻糖、L?阿拉伯糖、L?半乳糖、D?葡萄糖和D?甘露糖，相应比例为1.00∶1.53∶7.27∶9.07∶2.09。
【技术特征摘要】
1.一种鲨鱼糖蛋白，其特征在于该鲨鱼糖蛋白的分子量为26.4Da，其中糖和蛋白含量分别为33.65%和66.35%，该鲨鱼糖蛋白中单糖的组成包括L-岩藻糖、L-阿拉伯糖、L-半乳糖、D-葡萄糖和D-甘露糖，相应比例为1.0O: 1.53: 7.27: 9.07: 2.09。2.根据权利要求1所述的鲨鱼糖蛋白，其特征在于所述鲨鱼糖蛋白中有17种氨基酸，其中IOOg总氨基酸中含有丙酸酸10.4g，精氨酸5.9g，天冬氨酸8.3g，半胱氨酸0.lg，谷氨酸8.7g，甘氨酸15.6g，组氨酸0.2g，异亮氨酸1.2g，亮氨酸2.9g，赖氨酸2.2g，蛋氨酸0.9g,苯丙氨酸2.6g,脯氨酸9.5g,丝氨酸16.7g,苏氨酸8.9g,酪氨酸0.3g,缴氨酸5.6g。3.根据权利要求1所述的鲨鱼糖蛋白，其特征在于所述鲨鱼糖蛋白的组分在280nm处有蛋白质特征吸收值，同时用苯酚-硫酸法检测时，在490nm有多糖特征吸光值的组分。4.根据权利要求1所述的鲨鱼糖蛋白，其特征在于所述鲨鱼糖蛋白的糖肽的结合方式为N-糖肽键和O-糖肽键。5.一种根据权利要求1至4任一权利要求所述的鲨鱼糖蛋白的制备方法，其特征在于步骤为: 1)匀浆:g鱼肉于80% 95(V) %乙醇溶液中匀浆2 4min，匀浆液用0.5 1.5mol/L NaOH调pH值至8.5 9.5，用双蒸水调乙醇浓度至50% 70 (V) %，于20 30°C水浴中保温20 40min后，于3000 5000r/min离心10 20min,收集上清液；加NaCl将上清液的NaCl浓度调至5% IO(Wt) %，于20 30°C水浴中10 15小时，于3000 5000r/min离心10 20min,收集沉淀； 2)脱脂:将I)所得沉淀物加入乙醚处理2 3小时，过滤得沉淀物，冻干得脱脂蛋白粉末； 3)酶解:将2)所得脱脂蛋白粉末按照料液比1: ...
【专利技术属性】
技术研发人员：王斌，李忠瑞，罗红宇，邓尚贵，马佳卉，栗丽，
申请(专利权)人：浙江海洋学院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。