糖链异构体检测方法及糖链异构体检测装置制造方法及图纸

本发明专利技术的目的在于，开发并提供一种以少的工序数迅速且特异性地检测特定的糖链异构体的方法。提供一种糖链异构体检测方法，所述方法包括对在将与糖链非还原末端结合性凝集素及与糖链异构体的蛋白质部分特异性地结合的抗体等与被检试样混合时所形成的免疫复合物进行定量，将得到的免疫复合物量与未混合所述糖链非还原末端结合性凝集素时或混合对照蛋白质时的对照试样得到的对照免疫复合物量进行比较，以及基于这两个量之间的差异判定被检试样中目标糖链异构体的有无。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】糖链异构体检测方法及糖链异构体检测装置
本专利技术涉及一种可以检测具有特定糖链的糖蛋白异构体(糖链异构体)的糖链异构体检测方法及使用该方法的糖链异构体检测装置。
技术介绍
在以迎接老龄化社会的日本为首的先进各国中，存在老龄性疾病增加的倾向。其中，以阿尔茨海默病为代表的痴呆症的增加较为显著，由于伴有日常生活的困难性和家人等的护理负担的增加等，因此，在全社会成为大问题。但是，作为显示与阿尔茨海默病类似的症状的疾病，已知有特发性正常压力脑积水(idiopathicNormalPressureHydrocephalus；iNPH；以下称为“iNPH”)。流行病学调查显示，日本国内的痴呆症患者数超过300万人，据估算，其中阿尔茨海默病患者为半数以上，另外，特发性正常压力脑积水(iNPH)患者为31万人。两种疾病具有痴呆症和脑室扩大的共同特征，但在以下方面具有较大不同：阿尔茨海默病的根治疗法还没有被确立，而iNPH是可以通过手术如分流手术等而根治的“治愈的痴呆症”(非专利文献1)。但是，该分流手术数量在日本国内一年只有1,200例，在31万人的潜在患者中，接受该手术的患者仅每年度只有0.4％。其原因的实例包括由于鉴别阿尔茨海默病患者和iNPH患者的简便且可信的诊断方法没有确立，因此许多iNPH患者被误诊为阿尔茨海默病。iNPH的原因不清楚，怀疑是脊髓液吸收异常导致的脊髓液过量。在iNPH中，过量的脊髓液导致大脑受到压迫。因此，在iNPH的确定诊断中，采用包括通过腰椎穿刺除去大量的脊髓液并以是否缓和脑的压迫症状为指标的方法(穿刺实验)。但是，该方法为高侵袭性，而且假阴性率也高。另外，由于许多iNPH患者为高龄者，所以因腰椎变形而只能少量采集脊髓液，诊断自身也大多不能进行。因此，两种疾病的正确诊断方法的开发在医疗上成为重要的主题(非专利文献1)。为了解决上述问题，近年来，包括研究包含在体液中并与特定的疾病相关性高的糖蛋白，并将其作为诊断标志物用于疾病的病变判定的方法备受关注。体液中的大部分蛋白质被糖链修饰，这些糖链修饰通常具有特异于该糖链源自的脏器、组织、细胞种类或病态的结构。即，已知具有即使为相同的蛋白质，由于脏器、组织的不同，则具有不同的糖链。因此，通过利用糖链异构体，可以检测特定脏器的异常。例如，专利文献1公开了具有含末端N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的糖链的脊髓液型糖蛋白转铁蛋白-1(Tf-1)(脊髓液特征性糖链异构体)，作为可鉴别阿尔茨海默病和iNPH的诊断标志物(非专利文献2)。该方法可以通过脊髓液检测具有所述糖链的Tf-1而以高精度鉴别阿尔茨海默病和iNPH。另外，还可以鉴别额颞叶痴呆、路易氏体痴呆等其它痴呆症。另一方面，在脊髓液中，除Tf-1之外，还存在具有不同糖链结构的转铁蛋白异构体(转铁蛋白-2：Tf-2)。为了在这样的糖链异构体混合存在的脊髓液中检测特定的糖链异构体，目前，必须分别在不同工序中进行利用抗体的蛋白质部分的鉴别和利用凝集素的糖链部分的鉴别。这种检测方法缺乏效率性，另外迅速性差。进而，具有工序多且复杂而难以全自动化、不能大量处理的问题。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2010-121980号非专利文献非专利文献1：Ishikawaetal.,2008,Neurologiamedico-chirurgica,48,Supplement(GuidelinesforiNPH)非专利文献2：Futakawaetal.,2012,NeurobiolAging,33:1807-15.
技术实现思路
本专利技术的课题在于，开发并提供一种以少的工序数迅速且特异性地检测特定的糖链异构体的方法。本专利技术人等为了解决所述课题反复进行了潜心研究，结果发现以下现象：将凝集素与糖蛋白的糖链非还原末端结合时，抑制由特异性地识别该糖蛋白中的蛋白质部分的抗体引起的抗原抗体反应。而且，还得知该现象不是仅在使用特定限定的抗体时产生的特殊现象，而是在识别糖蛋白的蛋白质部分的一般抗体中观察到的普遍现象。抗体和凝集素针对糖蛋白的竞争迄今为止也有报道。例如，Suzuki等利用单克隆抗体和凝集素进行葡糖基化α-胎蛋白(AFP-L3)的定量(Suzuki,Y.,etal.,BrJCancer,1987,55(2):147-52)。该定量方法是包括通过在使用具有捕获用和检测用的2种抗AFP单克隆抗体的双抗夹心ELISA体系中添加LCA凝集素(lenscultinarisagglutinine；小扁豆凝集素)，并检测抗体与AFP-L3结合被LCA和AFP-L3结合的抑制作为ELISA信号的降低量来定量总AFP中的AFP-L3的方法，可定量具有核心岩藻糖的糖链异构体(AFP-L3)，而不将其从其它糖链异构体中分离。另外，Kato等公开有：在甲状腺癌中出现的含有核心岩藻糖的糖蛋白甲状腺球蛋白的检测，几个抗甲状腺球蛋白单克隆抗体与抗原的结合通过与核心岩藻糖结合的AAL凝集素的存在被抑制(Kato,R.etal.,JournalofKagawaPrefecturalCollegeofHealthScience,2003.5:39-44)。利用上述LCA和AAL凝集素的抗体结合的抑制机制被认为是：在糖链异构体中，通过将所述凝集素与从与氨基酸直接结合的糖分支的岩藻糖，即核心糖链中的核心岩藻糖结合，位于该核心糖链的附近的抗原表位被遮蔽，其结果是与抗体的反应性降低(Suzuki,Y.,etal.,BrJCancer,1987,55(2):147-52)。即，在免疫复合物的形成抑制中，认为糖蛋白的抗原表位和凝集素结合部位的接近性是重要的。一般而言，蛋白质上非常有限数目的抗原表位被糖链基部结合性凝集素遮蔽，大部分单克隆抗体可与糖蛋白结合而不与凝集素竞争。事实上，与糖蛋白的结合被糖链基部结合性凝集素中的核心岩藻糖结合凝集素抑制的单克隆抗体在所研究的30克隆中仅为2克隆(TaketaK,etal,TumourBiol,1998,19:318-28.)。另一方面，由于糖链非还原末端存在于蛋白质的远端，因此糖链非还原末端结合性凝集素不能抑制抗原抗体反应的说法是该领域的一般说法。因此，可以认为，抗体和凝集素针对糖蛋白的竞争不是普遍的现象，而是可以通过与糖链基部结合的极少一部分的单克隆抗体和糖链基部结合性凝集素的组合而产生的极其特殊的现象。但是，本专利技术人等所发现的上述现象为完全推翻现有说法的结果。即，迄今为止有报道的与核心糖链结合的凝集素的抗原抗体反应抑制能力表明：以完全不同的机制抑制糖蛋白和抗体的结合。本专利技术是基于上述新现象而完成的专利技术，提供以下专利技术。(1)一种所述糖链异构体检测方法，其为检测被检试样中的目标糖链异构体的方法，其中，所述方法包括：凝集素混合工序，将糖链非还原末端结合性凝集素与所述被检试样进行混合，所述糖链非还原末端结合性凝集素与所述目标糖链异构体的糖链部分中的糖链非还原末端的全部或一部分区域结合；抗体混合工序，将与所述目标糖链异构体中的蛋白质部分特异性地结合的抗体或其活性片段与所述被检试样进行混合；复合物定量工序，定量所述凝集素混合工序及抗体混合工序后所述抗体或其活性片段和所述目标糖链异构体的免疫复合物；及判定工序，基于所述免疫复合物量和相对于本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种糖链异构体检测方法，其检测被检试样中的目标糖链异构体，所述方法包括：凝集素混合工序，将糖链非还原末端结合性凝集素与所述被检试样进行混合，所述糖链非还原末端结合性凝集素与所述目标糖链异构体的糖链部分中的糖链非还原末端的全部或一部分区域结合；抗体混合工序，将与所述目标糖链异构体中的蛋白质部分特异性地结合的抗体与所述被检试样进行混合；复合物定量工序，定量所述凝集素混合工序及抗体混合工序后所述抗体和所述目标糖链异构体的免疫复合物；及判定工序，基于所述免疫复合物量与未混合所述糖链非还原末端结合性凝集素时或混合对照蛋白质时的对照试样得到的对照免疫复合物量的差异，判定被检试样中的目标糖链异构体的有无。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.08.10 JP 2012-1787221.一种糖链异构体检测方法，其检测被检试样中的目标糖链异构体，所述方法包括：凝集素混合工序，将糖链非还原末端结合性凝集素与所述被检试样进行混合，所述糖链非还原末端结合性凝集素与所述目标糖链异构体的糖链部分中的糖链非还原末端的全部或一部分区域结合；抗体混合工序，将与所述目标糖链异构体中的蛋白质部分特异性地结合的抗体与所述被检试样进行混合；复合物定量工序，定量所述凝集素混合工序及抗体混合工序后所述抗体和所述目标糖链异构体的免疫复合物；及判定工序，基于所述免疫复合物量与未混合所述糖链非还原末端结合性凝集素时或混合对照蛋白质时的对照试样得到的对照免疫复合物量的差异，判定被检试样中的目标糖链异构体的有无，其中所述糖链部分中的糖链非还原末端选自由以下组成的组：α2,6-唾液酸、α2,3-唾液酸、半乳糖、GalNAc、GlcNAc、聚乳糖胺和血型抗原岩藻糖，其中所述糖链非还原末端结合凝集素选自由以下组成的组：α2,6-唾液酸结合凝集素、α2,3-唾液酸结合凝集素、半乳糖/GalNAc结合凝集素、GlcNAc结合凝集素、聚乳糖胺结合凝集素和血型抗原岩藻糖结合凝集素。2.根据权利要求1所述的糖链异构体检测方法，其中，在所述判定工序中，当免疫复合物量于统计学上显著低于对照免疫复合物量时，判定为在所述被检试样中含有所述目标糖链异构体。3.根据权利要求1所述的糖链异构体检测方法，其中，在所述凝集素混合工序后进行所述抗体混合工序。4.根据权利要求1所述的糖链异构体检测方法，其中，在所述抗体混合工序后进行所述凝集素混合工序。5.根据权利要求1所述的糖链异构体检测方法，其中，将所述凝集素混合工序和所述抗体混合工序同时进行。6.根据权利要求1所述的糖链异构体检测方法，其中，所述被检试样为体液或组织切片。7.根据权利要求1所述的糖链异构体检测方法，其中，所述α2,6-唾液酸结合凝集素选自由SSA、SNA和TJA-I组成的组。8.根据权利要求1所述的糖链异构体检测方法，其中，所述α2,3-唾液酸结合凝集素是MAL。9.根据权利要求1所述的糖链异构体检测方法，其中，所述半乳糖/GalNAc结合凝集素选自由ECA、RCA120、BPL、TJA-II和WFA组成的组。10.根据权利要求1所述的糖链异构体检测方法，其中，所述GlcNAc结合凝集素选自由PVL、UDA、GSL-II和ABA组成的组。11.根据权利要求1所述的糖链异构体检测方法，其中，所述聚乳糖胺结合凝集素是LEL或STL。12.根据权利要求1所述的糖链异构体检测方法，其中，所述血型抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：成松久，久野敦，池原让，桥本康弘，城谷圭朗，奈良清光，苅谷庆喜，伊藤浩美，星京香，
申请(专利权)人：独立行政法人产业技术综合研究所，
类型：发明
国别省市：日本;JP