反胶团法分离萃取鱼精蛋白制造技术

本发明专利技术提供了一种反胶团法分离萃取鲢鱼鱼精蛋白的方法，其特征是包括如下步骤：制备鲢鱼鱼精蛋白粗提液，进行微滤、超滤，调整滤液pH值和离子强度，配制反胶团溶液和反萃取水相溶液，萃取和反萃取步骤，通过改进反胶团法中反胶团体系的配比、萃取水相中离子种类和离子强度、pH值、反萃取温度以及在反萃取水相中附加物质，提高了反胶团法的纯化效率，使得鲢鱼鱼精蛋白的酶活回收率高于98.5%，纯化因子达到3，克服了现有技术中反胶团萃取鱼精蛋白酶活回收率和纯化因子不高的缺陷。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物活性物质分离纯化
，尤其涉及一种利用反胶团法分离萃取鱼精蛋白的方法以及萃取工艺的优化改进。
技术介绍
鱼精蛋白又称精蛋白(Protamine)是一种多聚阳离子天然肽类，是一种存在于鱼 类成熟精巢中的碱性蛋白，与DNA以非共价键紧密结合在一起，以核精蛋白的形式存在。鱼精蛋白是一种小而简单的球形碱性蛋白质，其分子量较小，从几千到一万多道尔顿。一般由30个左右氨基酸组成，其中2/3以上是精氨酸。它能溶于水或稀酸中，不易溶于乙醇、丙酮等有机溶剂，稳定性好，加热不凝固，热稳定性较好，120°C 30min也能维持活性，等电点在10 — 12之间，带正电荷。根据碱性氨基酸组成的种类和数量的不同，可将鱼精蛋白分为单鱼精蛋白、双鱼精蛋白和三鱼精蛋白。其中，单鱼精蛋白仅含一种组分精氨酸，如鲑、鲱和虹鳟精蛋白等；双鱼精蛋白含有精氨酸、组氨酸或赖氨酸，如鲤精蛋白；三鱼精蛋白含有三种碱性氨基酸，如鲢、鲟精蛋白。研究表明常见的鱼精蛋白并不是单一组分，通常是由几种相互非常类似的组分组成的混合物。鱼精蛋白在鱼类精巢中的含量极不稳定，随性腺的成熟度而变化很大。鱼精蛋白存在于雄性个体的精巢组织中，是在精子成熟过程中代替组氨酸的。从研究报道的资料看，各国对鱼精蛋白的研究，多以鲑鱼为对象。目前，我国学者已经成功的从鲮鱼、罗非鱼、鲢鱼、鲤鱼等淡水鱼精巢中提取了鱼精蛋白。鱼精蛋白的提取基本上以硫酸或盐酸为主要提取剂，以柠檬酸或有机溶剂为纯化剂，其获得的是鱼精蛋白粗品，还含有其他物质如核酸、杂蛋白等，需要进一步纯化，一般采用葡聚糖凝胶柱层析法纯化，再利用等电聚焦电泳和生物质谱的方法对其等电点和分子量进一步测定。传统的鱼精蛋白分离纯化工艺都比较复杂，纯化周期也较长，有待于新的纯化工艺的使用。反胶团萃取是近年发展起来的分离和纯化生物物质的新方法。反胶团是表面活性剂溶于有机溶剂中形成的纳米级聚集体，是一种透明、稳定的热力学体系。反胶团中表面活性剂非极性尾基向外与有机溶剂接触，极性头基向内形成极性核，极性核溶入水后形成微“水池”，当反胶团与含蛋白质的水相接触时，蛋白质在表面活性剂核蛋白质所带电荷间的静电相互作用以及疏水作用等作用力下进入微“水池”中，使蛋白质避免和有机溶剂接触，不致失活。反胶团萃取蛋白质技术包含两个过程一个过程是蛋白质从水相转移到反胶团中(正萃取过程)，第二个过程是目标蛋白质从反胶团相转移到一个新的水相(反萃取过程)，从而实现蛋白质的分离与纯化。反胶团萃取具有选择性高、萃取过程简单，且正向萃取和反向萃取可同时进行，并能有效防止大分子失活、变性等优良特性，因此，在制药、食品工业、农业、化工等领域等到了极大的研究和应用。专利ZL200810079320. 5利用反胶团法直接从鱼精蛋白粗体液中分离纯化出鱼精蛋白，克服了目前纯化工艺复杂、步骤多、周期长的问题，但是该方法获得的纯化鱼精蛋白酶活回收率仅达到96%，纯化因子也只有2.1。鉴于现有的反胶团萃取鱼精蛋白所存在的酶活回收率、纯化因子较低的问题，本申请针对影响萃取工艺的各个环节进行改进，以提高鱼精蛋白的酶活回收率和纯化因子。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是在于需要提供一种反胶团法分离萃取鱼精蛋白的方法，并对其蛋白提取、前萃取和反萃取工艺进行改进，从而弥补现有技术中存在的酶回收率和纯化因子低的问题。本专利技术所述的反胶团法是利用表面活性剂在非极性有机溶剂中超过一定浓度后自发形成的一种亲水性基团向内、内含微小水滴的纳米级集合性胶体实现对蛋白质的分离萃取。 为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种反胶团法分离萃取鲢鱼鱼精蛋白的方法，具体步骤如下第一步制备鲢鱼鱼精蛋白粗提液，第二步进行微滤、超滤，第三步调整滤液PH值和离子强度，第四步配制反胶团溶液和反萃取水相溶液，第五步经萃取和反萃取步骤获得酶活回收率高于98. 5%的鱼精蛋白纯品。其中，所述鲢鱼鱼精蛋白粗体液的制备方法为取2400g鲢鱼鱼白组织匀浆，加入IN H2SO4于20°C抽提lh，然后5100g离心30min，收集上清液加入浓度为30%的NaOH调节pH值为8. 5，继续5100g离心30min，收集的上清即为鱼精蛋白粗提液。其中，所述微滤、超滤步骤为将收集的上清液加入IN HCl置于(TC过夜处理，进行真空抽滤(Whatman # 2)，收集上清，再使用Millipore TFF IOKDa NMWL进行超滤处理。其中，所述超滤液用O. 2mol/L Na2HPO4-NaOH缓冲液调节pH值为8. 5，使用2 mol/LKCl调节溶液的离子强度为O. 15 mol。其中，所述反胶团溶液的配制方法为，将表面活性剂二 - (2 —乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠(AOT)和聚氧乙烯基壬基酚醚(0PE4)按6:4的配比加入正己烷中，并添加4%正丁醇作为助溶剂，用含I mol/LKCl的磷酸盐缓冲液洗涤3次，即得透明澄清的反胶团溶液。其中，所述反萃取水相的配制方法为，配置含有I m0l/LKCl、15%异丙醇的反萃取水相溶液，添加正戊醇和蔗糖，使其浓度分别为3%和O. 75mol/L。其中，所述萃取步骤为将调节过pH值和离子强度的鱼精蛋白粗体液与反胶团溶液以重量份1:1加入到三角瓶中，振荡IOmin, 8000rpm/min离心5分钟,使两相分离。其中所述反萃取步骤为将负载鱼精蛋白的反胶团溶液与反萃取水溶液以1:1体积混合，45°C下振荡IOmin,8000rpm/min离心5分钟,使两相分离,水相中即含所提纯的鱼精蛋白。有益效果通过上述步骤，获得酶活回收率高于98. 5%，纯化因子为3的鲢鱼鱼精蛋白纯品。本专利技术在已有的反胶团法提取鱼精蛋白萃取技术的基础上，改良萃取工艺通过控制反胶团中表面活性剂的比例、PH值、离子强度、反萃取温度以及添加适当的助溶剂和提高酶活性的化学组分，达到高效萃取酶活蛋白的目的。同已有的反胶团法相比，它具有纯化率高，酶活性保留好等特点。附图说明图1表示pH为8. 5条件下鱼精蛋白萃取率和反胶团含水率随KCl和NaCl变化的情况； 图2表示水相pH值对鱼精蛋白萃取率的影响； 图3表示温度对反萃取率和酶活回收率的影响。具体实施例方式本专利技术提供了一种反胶团法分离萃取鲢鱼鱼精蛋白的方法，具体步骤如下第一步制备鲢鱼鱼精蛋白粗提液，第二步进行微滤、超滤，第三步调整滤液pH值和离子强度，第四步配制反胶团溶液和反萃取水相溶液，第五步经萃取和反萃取步骤获得酶活回收率高于98. 5%的鱼精蛋白纯品。所述鲢鱼鱼精蛋白粗体液的制备方法为取2400g鲢鱼鱼白组织匀楽,加入IN H2SO4于20°C抽提lh，然后5100g离心30min，收集上清液加入浓度为30%的NaOH调节pH值为8. 5，继续5100g离心30min，收集的上清即为鱼精蛋白粗提液。所述微滤、超滤步骤为将收集的上清液加入IN HCl置于0°C过夜处理，进行真空抽滤(Whatman # 2)，收集上清，再使用Millipore TFF IOKDa NMWL进行超滤处理。所述超滤液用O. 2mol/L Na2HPO4-NaOH缓冲液调节pH值为8. 5，使用2 mol/LKCl调节溶液的离子强度为O. 15 mol。所述反胶团溶液的配制方法为，将表面活本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种反胶团法分离萃取鲢鱼鱼精蛋白的方法，其特征是包括如下步骤：制备鲢鱼鱼精蛋白粗提液，进行微滤、超滤，调整滤液pH值和离子强度，配制反胶团溶液和反萃取水相溶液，经萃取和反萃取步骤获得酶活回收率高于98.5%的鱼精蛋白纯品。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张永勤，张春革，
申请(专利权)人：青岛亚博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：