本发明专利技术公开了斜带石斑鱼补体C3基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用。石斑鱼rC3B蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:4所示，或者是SEQIDNO:4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等或更高活性的蛋白。本发明专利技术首次获得了石斑鱼的补体C3基因序列以及C3序列上的功能片段rC3B核苷酸序列，不仅丰富了石斑鱼的基因库，而且可应用于制备重组蛋白、鱼类免疫制剂或饲料添加剂，为石斑鱼的生理免疫研究提供了新的理论与实践基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种rC3B蛋白及编码该蛋白的基因、含有该基因的载体及其应用；还涉及一种补体C3蛋白及编码该蛋白的基因、含有该基因的载体及其应用。
技术介绍
补体第三组分(C3)是补体系统的核心，它是1912年Ritg用蛇毒处理血清时发现的。在补体各成分中，补体C3的血清含量最高。补体C3蛋白具有特殊的结构，是一种β 2糖蛋白，由α、β两条肽链组成，两肽链间以二硫键相连，分子量为195KDa，其中α链为115KDa，由998个氨基酸残基组成，N末端和C末端均为丝氨酸；β链为75KDa，由669个氨基酸组成，N末端为丝氨酸，C末端为丙氨酸。两链间氢键、疏水键及二硫键相互连接，其 中二硫键散在于α链的92-93位氨基酸及β链的11-656位氨基酸之间。C3的激活与灭活酶的作用部位主要在α链，β链则与稳定必要的分子构象有关。在α链的半胱氨酸和谷氨酸残基之间有一个分子内硫酯键，此键不稳定，尤其是对蛋白质和碳水化合物中的亲核基团敏感，如羟基(一 0Η)和氨基(一順2)。C3当被C3转化酶裂解为C3a和C3b时，C3b分子内硫酯键变得更加不稳定，可被附近的羟基或氨基激活，断裂为酰基和巯基。酰基具有较强的亲电性，可与相应膜表面的亲核基团形成酯键或酰氨键，由此C3b结合于相应的膜表面，此结合部位为C3b的不稳定结合部位，借此部位，C3b除可结合于细胞膜表面外，还可结合于相应的免疫复合物、脂多糖、酵母多糖及多糖等。在功能上，C3亦居于中心地位，它既是3条激活途径的交汇，又是C3b依赖性阳性反馈环路的基础；同时C3裂解片段及其结合蛋白复杂而多样。C3分子上存在着众多与其他分子的结合位点，C3通过其上的系列受体位点与补体其它成分、病原体、血细胞等发生广泛的作用，从而在机体的免疫防御和免疫病理中发挥重要作用。rC3B是C3上与单核细胞、巨噬细胞表面补体受体的结合位点，也就是补体III型受体(CR3，⑶Ilb /⑶18 )结合位。C3裂解片段通过该结合位点与大量存在于单核细胞、中性粒细胞等上的C R 3结合，从而促进机体对血液中病原体的吞噬和清除，提高鱼类抗病性，增强鱼类自身的免疫力。石斑鱼类隶属S卢形目iPerciformes),鯧科{Serranidae),石斑鱼亚科(Bpinephelinae),石斑鱼属(Bpinephelus),为暖水性礁栖鱼类,广泛分布于印度洋和太平洋的热带、亚热带海域。石斑鱼是驰名世界的名贵海产鱼类之一，其肉质鲜美，营养丰富，为餐桌中的上等佳肴，被港澳地区推为我国的四大名鱼之一，深受各地消费者的喜爱，经济价值巨大。但是，当前气候灾害和环境污染导致的高致病率和高死亡率，一直是石斑鱼人工养殖过程中难以解决的问题。市场上还没有一种能够有效增强石斑鱼免疫力的饲料添加剂。酵母是最简单的真核生物，以其作为宿主表达外源蛋白有很大的优势生长繁殖快，易培养，操作简单；能对表达的外源蛋白进行翻译后加工修饰，如糖基化、乙酰化等；安全性高，无致病性。巴斯德毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母，能将甲醇作为代谢的唯一碳源和能源。毕赤酵母表达系统有很多优点在科研及生产中广泛应用使用强的可诱导启动子-AOXl基因启动子；外源基因以单拷贝或多拷贝定点整合入基因组中，遗传稳定性好；重组蛋白以高水平分泌到几乎无蛋白的培养基中，利用表达蛋白的纯化；容易进行高密度发酵，适合于产业化生产。
技术实现思路
本专利技术的一个目 的在于提供一种石斑鱼rC3B蛋白。本专利技术的另一目的在于提供编码上述石斑鱼rC3B蛋白的基因。本专利技术的另一目的在于提供一种石斑鱼rC3B蛋白的前体蛋白，即石斑鱼补体C3蛋白。本专利技术的另一目的在于提供编码上述石斑鱼补体C3蛋白的基因。本专利技术的另一目的在于提供含有石斑鱼补体C3蛋白基因及功能片段rC3B的克隆载体。本专利技术的另一目的在于提供含有石斑鱼补体C3蛋白基因及功能片段rC3B的表达载体。本专利技术的另一目的在于提供一种石斑鱼补体C3功能片段rC3B重组蛋白及其制备方法。本专利技术的另一目的在于提供石斑鱼rC3B蛋白和/或C3蛋白在制备提高鱼类免疫力制剂中的应用。本专利技术所采取的技术方案是 石斑鱼rC3B蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示,或者是SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等或更高活性的蛋白。编码上述石斑鱼rC3B蛋白的基因。其核苷酸序列如SEQ ID NO : 3所示。石斑鱼补体C3蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，或者是SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等或更高活性的蛋白。编码上述石斑鱼补体C3蛋白的基因。其核苷酸序列如SEQ ID NO : I所示。生产石斑鱼rC3B蛋白或石斑鱼补体C3蛋白的方法，包括将上述表达载体导入宿主细胞中，表达得到rC3B蛋白或C3蛋白。本专利技术的有益效果如下 1.本专利技术首次获得了石斑鱼的补体C3基因序列以及C3序列上的功能片段rC3B核苷酸序列，不仅丰富了石斑鱼的基因库，而且可应用于制备重组蛋白、鱼类免疫制剂或饲料添加剂，为石斑鱼的生理免疫研究提供了新的理论与实践基础； 2.将石斑鱼rC3B核苷酸序列在毕赤酵母重组株表达，可以大量生产石斑鱼rC3B重组蛋白，大大降低了生产成本，具有很高的经济价值； 3.本专利技术所提供的石斑鱼rC3B重组蛋白，经实验证明具有提高石斑鱼免疫力等功能，可以应用于制备鱼类尤其是石斑鱼免疫制剂或饲料添加剂，具有广阔的应用前景。附图说明 图I是斜带石斑鱼补体C3基因5’端片段合成的第二次PCR凝胶电泳分析图；图2是斜带石斑鱼补体C3基因3’端片段合成的第二次PCR凝胶电泳分析 图3是C3基因ORF的PCR扩增产物的电泳鉴定图。图4是斜带石斑鱼补体C3功能片段rC3B的PCR扩增产物的凝胶电泳分析 图5是克隆载体pMD18-T-rC3B双酶切(McoRI ,XbaI)验证 图6是表达载体pPICZaA-rC3B双酶切(McoRUXbaD验证 图7是重组株pPICZaA-rC3B-X-33表达产物rC3B重组蛋白的SDS-PAGE电泳分析图； 图8是重组株pPICZaA-rC3B-X-33表达产物rC3B重组蛋白的western_blot鉴定图； 图9是pPICZaA-rC3B毕赤酵母表达载体构建示意 图10是石斑鱼rC3B的氨基酸序列和人类rC3B氨基酸序列的对比图； 图11是rC3B抗原表位预测分析； 图12是重组株pPICZaA-rC3B-X-33高密度发酵产物rC3B重组蛋白的SDS-PAGE电泳分析图(M :蛋白分子量标准；1 pPICZaA- rC3B -X-33发酵产物；NC :阴性对照pPICZ α Α-33发酵产物); 图13是在低温应激中的，Α，B, C三组鱼血细胞数目随应激时间的变化情况(*表示与对照组相比有显著性差异，P <0.0 = 5)； 图14是在低温应激中A、B、C三组鱼血细胞呼吸爆发水平随应激时间的变化情况(*表示与对照组相比有显著性差异，P < O. 05); 图15是在低温应激中A、B、C三组鱼血细胞凋亡情况随应激本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
2011.05.24 CN 201110134612.61.石斑鱼rC3B蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO: 4所示,或者是SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等或更高活性的蛋白。2.编码权利要求I所述石斑鱼rC3B蛋白的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQID N0:3所示。4.石斑鱼补体C3蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO :2所示,或者是SEQ ID N0:2所...
【专利技术属性】
技术研发人员：王维娜，祁增华，刘玉凤，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：
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