一种鱼类CD59的重组蛋白的应用制造技术

本发明专利技术涉及免疫学领域，具体的说是鱼类(半滑舌鳎)CD59的重组蛋白的应用。CD59的重组蛋白rCD59在制备抑制血清补体激活制剂中的应用。CD59重组蛋白是以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增CD59基因，扩增产物经诱导表达、纯化即为重组蛋白。本发明专利技术CD59重组蛋白能够显著抑制血清补体激活。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫学领域，具体的说是鱼类(半滑舌鳎)CD59的重组蛋白的应用。
技术介绍
CD59是一种膜蛋白分子，通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定在细胞膜上，属于Ly-6蛋白超家族的成员。在哺乳动物中，CD59广泛存在于红细胞、淋巴细胞和内皮细胞等细胞表面，也广泛分布在肝脏、脾脏和肾脏等大部分组织中。在哺乳动物中，CD59具有抑制补体激活的活性；CD59可以结合C5b-8复合物中C8的α链，也可以结合C9的b结构域，从而抑制C9的多聚化，阻止补体膜攻击复合物的形成,保护自身细胞免遭补体介导的裂解细胞作用。目前，CD59已经在斑马鱼、罗非鱼等鱼类中报道，但是其功能和应用研究尚缺乏。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种鱼类CD59的重组蛋白的应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种鱼类CD59的重组蛋白的应用，CD59的重组蛋白rCD59在制备抑制血清补体激活制剂中的应用。所述CD59的重组蛋白rCD59在制备抑制鱼类(半滑舌鳎)血清补体激活制剂中的应用。所述CD59重组蛋白为在大肠杆菌中表达获得重组蛋白。所述重组CD59蛋白为以半滑舌鳎cDNA为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增,PCR产物经过与载体T-Simple连接转换后与载体pET32a连接，获得质粒pEtCD59，转化大肠杆菌BL21(DE3)即可表达重组CD59。所述F1为5’-AGCGGATATCCTGCAGTGTTATTCCTGTC-3’；R1为5’-AGCGGATATCTCCAAAAAAATTCTTGAA-3’。本专利技术具有如下优点：本专利技术的CD59重组蛋白，能够显著抑制鱼类(半滑舌鳎)血清补体激活。附图说明图1为本专利技术实施例提供的重组CD59(rCD59)电泳图。A图：泳道1，分子量标准；泳道2,rCD59。B图：泳道1，分子量标准；泳道2,rTrx。下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例旨在对本专利技术进行举例描述，而非以任何形式对本专利技术进行限制。在本专利技术实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。2.大肠杆菌用Hanahan方法(Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)。3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。实施例1CD59重组蛋白rCD59的制备1)表达CD59重组蛋白rCD59的质粒pEtCD59的构建：本专利技术的CD59序列已公布(GenBank accession number XP_008329743.1)。CD59由107个氨基酸组成，具有一个典型的GPI-anchoring region结构(氨基酸残基92-106)。以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增CD59基因。PCR条件为：94℃ 60s预变性模板DNA,然后94℃ 40s,48℃ 60s,72℃ 65s,5个循环，然后94℃ 40s,60℃ 60s,72℃ 65s,30个循环后再在72℃延伸反应7－10min。PCR产物用天根的相应试剂盒纯化。表达载体pET32a(Novagen,San Diego,USA)是一个常用的原核表达载体，带有一个标签蛋白Trx，该蛋白与被表达的蛋白形成融合蛋白，可提升某些难以表达的蛋白的表达效率。将pET32a用限制性内切酶EcoRV酶切后回收，将其与上述纯化的PCR产物用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α，在含有氨苄青霉素(ampicillin)(100ug/ml)的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，命名为pEtCD59。通过DNA测序分析证明了pEtCD59为含有上述GPI-anchoring region结构域的CD59序列的表达质粒，其中CD59基因与pET32a的标签蛋白Trx基因融合，因此该质粒表达的rCD59蛋白是CD59和Trx的融合蛋白。所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨,0.5％酵母粉,1.0％氯化钠,97.5％蒸馏水。所述F1为5’-AGCGGATATCCTGCAGTGTTATTCCTGTC-3’；R1为5’-AGCGGATATCTCCAAAAAAATTCTTGAA-3’。2)rCD59和对照蛋白rTrx(重组标签蛋白Trx)的诱导表达和纯化将上述的质粒pEtCD59和pET32a分别用常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有氨苄青霉素(ampicillin)(100ug/ml)的LB固体培养基上培养18－24小时,挑取转化子，将其命名为BL21/pEtCD59和BL21/pET32a。将BL21/pEtCD59和BL21/pET32a于含有氨苄青霉素(ampicillin)(50ug/ml)的LB液体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液,加入100ml新鲜的含有氨苄青霉素(ampicillin)(50ug/ml)的LB液体培养基中，于37℃下转速200rpm摇动培养至OD600为0.6,加入终浓度为0.1mM的IPTG，16℃继续以转速160rpm摇动培养16h，而后以5000g，4℃离心10min，收集菌液，加入5ml裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液以10000g，4℃离心30min，回收上清。将上清中的蛋白用亲和层析柱His Trap HP Columns(购于美国GE Healthcare公司)回收纯化。将纯化的蛋白在PBS中透析20-24h。将纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测(8v/cm电压下电泳25－30min，随后15v/cm电压下电泳2－2.5h)，测定其分子量大小(参见图1)。发现rCD9和rTrx的蛋白质质量分别与CD59和Trx相同。所述裂解液为终浓度的10mM NaH2PO4、10mM Tris和8M尿素,pH 8.0。所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％NaCl,0.02％KCl,0.358％Na2HPO4.12H2O,0.024％NaH2PO4，余量为水。实施例2rCD59抑制血清补体激活的作用半滑舌鳎血清在含有0.01M MgCl2的Hank’s Balanced Salt Solution(HBSS)(购于北京Solarbio公司)中稀释8倍，即为稀释血清。兔血红细胞(购于Guangzhou Future Technology Co.,Ltd,)在HBSS中悬浮至1x109cells/ml，即为血红细胞悬液。30ul血红细胞悬液与300ul稀释血清混合，将混合液等体积分为三份，命名为A,B和C。在A和B中分别加入10ul 300μg/ml的rCD59和rTrx，在C中加入10ul PBS(对照组)。将三组在22℃保温20min,随后离心(600g)10min。取上清，在OD450检测吸光值。吸光值越高则表示血清中激活的补体量越多。结果表明，C组(对照组)的吸光本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鱼类CD59的重组蛋白的应用，其特征在于：CD59的重组蛋白rCD59在制备抑制血清补体激活制剂中的应用。

【技术特征摘要】
1.一种鱼类CD59的重组蛋白的应用，其特征在于：CD59的重组蛋白rCD59在制备抑制血清补体激活制剂中的应用。2.按权利要求1所述鱼类CD59的重组蛋白的应用，其特征在于：CD59的重组蛋白rCD59在制备抑制鱼类血清补体激活制剂中的应用。3.按权利要求1或2所述鱼类CD59的重组蛋白的应用，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙黎，隋智海，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37