本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体的说是半滑舌鳎补体成分C5a(CsC5a)的重组蛋白及其应用。半滑舌鳎补体成分C5a的重组蛋白以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物C5F1和C5R1进行PCR扩增补体成分CsC5a基因，扩增产物经诱导表达、纯化即为重组蛋白。本发明专利技术补体成分CsC5a重组蛋白能够显著促进免疫细胞吞噬作用，提高鱼类的抗细菌或抗病毒能力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，具体的说是半滑舌鳎补体成分C5a(CsC5a)的重组蛋 白及其应用。
技术介绍
补体因子5(Complement factor 5，C5)是补体系统的一个成分。人类C5蛋白由α、β 两条多肽链通过二硫键组成，分子量为190kDa<X5靠近N端的第74-75位精氨酸-亮氨酸键为 C5转化酶作用的部位。补体系统通过三条途径(经典途径、旁路途径和凝集素途径)激活后， 均生成C5转化酶。C5蛋白在C5转化酶的作用下裂解为C5a和C5b两个片段。C5a是C5的α链的N 端约S-IOkD的肽段，是炎症反应的重要介质和趋化因子。C5a通过与细胞表面的C5a受体结 合而激活相应的信号通路，刺激白细胞产生呼吸爆发、趋化效应等炎症反应，从而辅助激活 机体的先天性免疫，促进获得性免疫应答。目前，C5和C5a已经在虹鳟和鲤鱼等鱼类中报道， 但是它们在鱼类中的应用性研究尚缺乏。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种。 为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为： -种半滑舌鳎补体成分C5a的重组蛋白，半滑舌鳎补体成分C5a的重组蛋白以半滑 舌鳎cDNA为模板，用引物C5F1和C5R1进行PCR扩增补体成分CsC5a基因，扩增产物经诱导表 达、纯化即为重组蛋白，所述C5F1 为5 ' -GATATCATGGAGAAGAGGATAAAAGCGGCA-3 ' ； C5R1 为5 ' -GATATCGCCGAGGACGAGGGTTTCCTCT-3 '。 -种半滑舌鳎补体成分C5a的重组蛋白的应用，所述半滑舌鳎补体成分C5a的重组 蛋白可用于制备增强外周血淋巴细胞的吞噬作用的制剂。 -种半滑舌鳎补体成分C5a的重组蛋白的应用，所述半滑舌鳎补体成分C5a的重组 蛋白可用于制备抑制细菌或病毒感染的制剂。 细菌为哈氏弧菌，是鱼类常见的致病性细菌，能感染多种养殖鱼类包括牙鲆、大菱 鲆、半滑舌鳎等。 病毒为细胞肿大病毒，是一种严重危害养殖鱼类的病毒，能感染大菱鲆、条石鲷、 半滑舌鳎等。 本专利技术具有如下优点:本专利技术的补体成分C5a重组蛋白，能够显著提高外周血淋巴 细胞的吞噬能力和增强鱼类的抗细菌及抗病毒能力。【附图说明】 图1为本专利技术实施例提供的重组补体成分C5a(命名为rCsC5a)电泳图。泳道1，分子 量标准;泳道2，补体成分rCsC5a。 图2为本专利技术实施例提供的重组补体成分rCsC5a的促吞噬作用。A，半滑舌鳎外周 血淋巴细胞（peripheral blood leukocytes，PBL) qE^PBL+FITC-标记的哈氏弧菌。C，PBL+ FITC-标记的哈氏弧菌+rCsC5a。【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例旨在对本专利技术进行举例描述，而 非以任何形式对本专利技术进行限制。 在本专利技术实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法： 1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用"天根生化科技(北 京)有限公司"的相应试剂盒。 2 ·大肠杆菌用Hanahan方法（Sambrook and Russel 1:Molecular Cloning : A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)〇 3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于"纽英伦生物技术有限公司"，北京。 实施例1 补体成分C5a重组蛋白rCsC5a的制备 1)表达补体成分C5a重组蛋白rCsC5a的质粒pCsC5a的构建： 本专利技术的补体成分rCsC5a为半滑舌鳎补体成分C5的一部分(氨基酸685-751)，C5 序列已公布（GenBank accession number ΧΡ_008334663· 1)〇 CsC5a由67个氨基酸组成，具有典型的anaphylatoxin结构。以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物C5F1和C5R1进行PCR扩增补CsC5a基因。PCR条件 为：94°C 60s预变性模板DNA，然后94°C 40s，62°C 60s，72°C 658,30个循环后再在72°(3延 伸反应7 - IOmin JCR产物用天根的相应试剂盒纯化。将表达载体pET259(构建过程参见Hu YH,Zheng Wff,Sun L.Identification and molecular analysis of a ferritin subunit from red drum(Sciaenops ocellatus) .Fish Shellfish Tmmunol 2010;28:678-86)用限 制性内切酶EcoRV酶切后回收5.3kb片段，将其与上述纯化的PCR产物用T4DNA连接酶连接， 连接液转化入大肠杆菌DH5a，在含卡那霉素（l〇〇ug/ml)的LB培养基上培养18 - 24小时，筛 选转化子提取质粒，命名为pCsC5a。通过DNA测序分析证明了 pCsC5a为含有上述C5结构域的 补体成分CsC5a序列的表达质粒。所述LB组成成分按重量百分比计：1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化钠， 97 · 5 % 蒸馏水。所述C5F1 为5 ' -GATATCATGGAGAAGAGGATAAAAGCGGCA-3 ' ； C5R1 为5 ' -GATATCGCCGAGGACGAGGGTTTCCTCT-3 '。 2)rCsC5a的诱导表达和纯化将上述的质粒pCsC5a用常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自于"天根生化科技 有限公司"，北京），在含有卡那霉素（50ug/ml)的LB固体培养基上培养18 -24小时，挑取转 化子，将其命名为BL21/pCsC5a。将BL21/pCsC5a于含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液体培养基 中过夜培养;取Iml过夜后的培养液，加入IOOrnl新鲜的含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液体培 养基中，于37°C下转速200rpm摇动培养至OD 6qq为0.6，加入终浓度为ImM的IPTG，16°C继续以 转速160rpm摇动培养16h，而后以5000g，4°C离心I Omin，收集菌液，加入5ml裂解液，在室温 于摇床上缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液以10000g，4°C离心30min，回收 上清。将上清中的蛋白用亲和层析柱His Trap HP Columns(购于美国GE Healthcare公司） 回收纯化。将纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测(8v/cm电压下电泳25 - 30min，随后15v/cm电 压下电泳2 - 2.5h)，测定其分子量大小（参见图1)。发现rCsC5a的蛋白质质量与补体成分 CsC5a相同。 所述裂解液为终浓度的IOmM NaH2P〇4、当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种半滑舌鳎补体成分C5a的重组蛋白，其特征在于：半滑舌鳎补体成分C5a的重组蛋白以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物C5F1和C5R1进行PCR扩增补体成分CsC5a基因，扩增产物经诱导表达、纯化即为重组蛋白，所述C5F1为5’‑GATATCATGGAGAAGAGGATAAAAGCGGCA‑3’；C5R1为5’‑GATATCGCCGAGGACGAGGGTTTCCTCT‑3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李墨非，孙黎，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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