一种刀豆球蛋白A的测定方法技术

一种刀豆球蛋白A的测定方法，属于化学发光技术领域，本发明专利技术是基于刀豆蛋白A识别氨基葡萄糖修饰磁性微球和链式杂交反应原理测定刀豆蛋白A的方法。在目标物刀豆蛋白A存在时，标记有不同DNA链的磁性微球相互靠近，磁性微球表面修饰的DNA发生杂交反应，然后，再与修饰有异硫氰酸荧光素FITC的发卡DNA：FITC-H1和FITC-H2进行杂交链式反应，利用光二极管诱导化学发光原理，根据化学发光强度，实现对刀豆蛋白A的测定。本发明专利技术测定方法简单、成本低、灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】
一种刀豆球蛋白A的测定方法
本专利技术属于化学发光
，涉及一种刀豆球蛋白A的测定方法。
技术介绍
刀豆球蛋白A(ConA)，又名刀豆凝集素、刀豆素，是一种植物血凝素，具有强力的促有丝分裂作用，有较好的促淋巴细胞转化反应的作用，其促淋巴细胞转化最适浓度为40-100μg/ml，能沉淀肝糖原，凝集羊、马、狗、兔、猪、大鼠、小鼠、豚鼠等动物及人红细胞。还能选择性激活抑制性T细胞(Ts细胞)，对调节机体免疫反应具有重要作用。因此，通过使用ConA来活化病态(或老年)时的Ts细胞这一途径，可望改观一些自身免疫性疾病，甚或在移植物排斥反应或恶性肿瘤的防治方面具有广泛的应用前景。近年来刀豆球蛋白A测定方法主要有：凝集抑制试验法(CarrottaR,VilasiS,LibrizziF,MartoranaV,BuloneD,SanBiagioPL.EntrapmentofAβ1-40peptideinunstructuredaggregates.JPhysChemB2012,116(50):14700-12707)；表面等离子体共振法(BellapadronaG,TeslerAB,GrünsteinD,HossainLH,KikkeriR,SeebergerPH,VaskevichA,RubinsteinI.Optimizationoflocalizedsurfaceplasmonresonancetransducersforstudyingcarbohydrate-proteininteractions.AnalChem.2012,84(1):232-240)；散射光测定法(BabuP,SinhaS,SuroliaA.Sugar-quantumdotconjugatesforaselectiveandsensitivedetectionoflectins.BioconjugChem.2007,18(1):146-151)；等温滴定量热法(WangX,MateiE,GronenbornAM,O,YanM.Directmeasurementofglyconanoparticlesandlectininteractionsbyisothermaltitrationcalorimetry.AnalChem.2012,84(10):4248-4252.)；电化学(LiuBQ,ZhangB,ChenGN,YangHH,TangDP.Proximityligationassaywiththree-wayjunction-inducedrollingcircleamplificationforultrasensitiveelectronicmonitoringofConcanavalinA.AnalChem.2014,86:86,7773-7781.)等。但是，这些方法的各有其缺点，本专利技术利用磁珠为载体，以异硫氰酸荧光素FITC为标记物，以光诱导化学发光原理，实现了刀豆球蛋白A的测定，具有方法简单、成本低、灵敏度高的优点。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种灵敏的测定刀豆球蛋白A的新方法，利用磁珠为载体，以FITC为标记物，实现刀豆球蛋白A的测定。技术方案本专利技术是基于刀豆蛋白A识别氨基葡萄糖修饰磁性微球链式杂交反应原理测定刀豆蛋白A的方法。在目标物刀豆蛋白A存在时，标记有不同DNA链的磁性微球相互靠近，磁性微球表面修饰的DNA发生杂交反应，然后，再与修饰有异硫氰酸荧光素FITC的发卡DNA：FITC-H1和FITC-H2进行杂交链式反应，利用光二极管诱导化学发光原理，根据化学发光强度，实现对刀豆蛋白A的测定。其特征为：a.将发卡DNA在使用之前孵化，然后，逐步降温至室温；b.取羧基化磁珠至小离心管中，并用Tris-HCl缓冲溶液洗涤两遍，并分散到Tris-HCl缓冲溶液中；c.将N-(3-(二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺加入步骤b中处理好的磁珠溶液中，将该混合物在室温下轻摇1h；d.将氨基化葡萄糖水溶液和DNA1加入步骤c所得溶液中，在4℃条件下，振动12h，反应完成后，将所得产物GA-MB-DNA1经过磁性分离，并用Tris-HCl缓冲溶液洗涤两遍，再分散到Tris-HCl缓冲溶液中；e.将氨基化葡萄糖水溶液和DNA2加入步骤c所得溶液中，在4℃条件下，振动12h，反应完成后，将所得产物GA-MB-DNA2经过磁性分离，并用Tris-HCl缓冲溶液洗涤两遍，再分散到Tris-HCl缓冲溶液中；f.将GA-MB-DNA1溶液和GA-MB-DNA2溶液混合，然后加入刀豆球蛋白A的样品溶液，在37℃下振荡反应30min，反应完全后，磁分离，并用磷酸缓冲溶液清洗两遍，并除去上清液；g.取含有FITC-H1和FITC-H2的磷酸缓冲溶液加入到步骤f所得溶液中，在37℃振荡反应1h，然后将磁珠用磷酸缓冲溶液清洗两遍，再将其分散于磷酸缓冲溶液中；h.取鲁米诺溶液于小烧杯中，并加入步骤g所得磁珠溶液，打开光二极管电源，照射一段时间后关闭电源，然后测定化学发光强度，根据化学发光强度实现刀豆球蛋白A的测定。测定具体步骤如下：(1)GA-MB-DNA1和GA-MB-DNA2探针的制备实验中的发卡DNA在使用之前在95℃下孵化2min，然后，逐步降温至室温。a.取10μL羧基化磁珠至1.5mL小离心管管中，并用100μLpH8.0Tris-HCl缓冲溶液洗涤两遍，并分散到100μL的Tris-HCl缓冲溶液中。b.将40mMN-(3-(二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐和10mMN-羟基琥珀酰亚胺加入上述处理好的磁珠溶液中，将该混合物在室温下轻摇1h。c.将5μL30μM氨基化葡萄糖水溶液和50μL5μM的DNA1加入上述所得溶液中。在4℃条件下振动12h。反应完成后，将所得产物GA-MB-DNA1经过磁性分离，并用100μLpH8.0的Tris-HCl缓冲溶液洗涤两遍，并分散到1mL的Tris-HCl缓冲溶液中。d.利用上述c类似的方法，合成氨基化葡萄糖和DNA2修饰的磁珠GA-MB-DNA2。(2)刀豆球蛋白A的测定a.将100μLGA-MB-DNA1溶液和100μLGA-MB-DNA2溶液混合，然后加入100μL刀豆球蛋白A的样品溶液，在37℃下振荡反应30min。反应完全后，磁分离，并用100μLpH6.8的磷酸缓冲溶液清洗两遍，并除去上清液。b.取100μL含有1.0×10-7MFITC-H1和1.0×10-7MFITC-H2的pH6.8的磷酸缓冲溶液加入到上述溶液中，在37℃振荡反应1h，将磁珠用100μLpH6.8的磷酸缓冲溶液清洗两遍，然后分散于100μLpH6.8的磷酸缓冲溶液中。(3)化学发光检测取200μLpH11.3的浓度为0.01M的鲁米诺溶液于小烧杯中，并加入上述所得50μL磁珠溶液。打开光二极管电源，照射15秒后关闭电源，然后测定化学发光强度，根据化学发光强度实现刀豆球蛋白A的测定。本专利技术的化学试剂优选分析纯试剂，所有溶液均用二次蒸馏水配置。优选的DNA1、DNA2、FITC-H1和FITC-H2的部分序列如下：DNA1：5’-GGATCCAACTCGCCAGGGTTAGCGT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种刀豆球蛋白A测定的方法，具体特征包括以下步骤：a.将发卡DNA在使用之前孵化，然后，逐步降温至室温；b.取羧基化磁珠至小离心管中，并用Tris‑HCl缓冲溶液洗涤两遍，并分散到Tris‑HCl缓冲溶液中；c.将N‑(3‑(二甲基氨基丙基)‑N‑乙基碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺加入步骤b中处理好的磁珠溶液中，将该混合物在室温下轻摇1h；d.将氨基化葡萄糖水溶液和DNA1加入步骤c所得溶液中，在4℃中条件下，振动12h，反应完成后，将所得产物GA‑MB‑DNA1经过磁性分离，并用Tris‑HCl缓冲溶液洗涤两遍，再分散到Tris‑HCl缓冲溶液；e.将氨基化葡萄糖水溶液和DNA2加入步骤c所得溶液中，在4℃中条件下，振动12h，反应完成后，将所得产物GA‑MB‑DNA2经过磁性分离，并用Tris‑HCl缓冲溶液洗涤两遍，再分散到Tris‑HCl缓冲溶液；f.将GA‑MB‑DNA1溶液和GA‑MB‑DNA2溶液混合，然后加入刀豆球蛋白A的样品溶液，在37℃下振荡反应30min，反应完全后，磁分离，并用磷酸缓冲溶液清洗两遍，并除去上清液；g.取含有FITC‑H1和FITC‑H2的磷酸缓冲溶液加入到步骤f的溶液中，在37℃振荡反应1h，然后将磁珠用磷酸缓冲溶液清洗两遍，再将其分散于磷酸缓冲溶液中；h.取鲁米诺溶液于小烧杯中，并加入步骤g所得磁珠溶液，打开光二极管电源，照射一段时间后关闭电源，然后测定化学发光强度，根据化学发光强度实现刀豆球蛋白A的测定。...

【技术特征摘要】
1.一种刀豆球蛋白A测定的方法，具体特征包括以下步骤：a.将发卡DNA1、发卡FITC-H1和发卡FITC-H2在使用之前孵化，然后，逐步降温至室温；b.取羧基化磁珠至小离心管中，并用Tris-HCl缓冲溶液洗涤两遍，并分散到Tris-HCl缓冲溶液中；c.将N-(3-(二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺加入步骤b中处理好的磁珠溶液中，将该混合物在室温下轻摇1h；d.将氨基化葡萄糖水溶液和DNA1加入步骤c所得溶液中，在4℃条件下，振动12h，反应完成后，将所得产物GA-MB-DNA1经过磁性分离，并用Tris-HCl缓冲溶液洗涤两遍，再分散到Tris-HCl缓冲溶液中；e.将氨基化葡萄糖水溶液和DNA2加入步骤c所得溶液中，在4℃条件下，振动12h，反应完成后，将所得产物GA-MB-DNA2经过磁性分离，并用Tris-HCl缓冲溶液洗涤两遍，再分散到Tris-HCl缓冲溶液中；f.将GA-MB-DNA1溶液和GA-MB-DNA2溶液混合，然后加入刀豆球蛋白A的样品溶液，在37℃下振荡反应30min，反应完全后，磁分离，并用磷酸缓冲溶液清洗两遍，并除去上清液；g.取含有FITC-...

【专利技术属性】
技术研发人员：混旭，宋天琦，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：山东;37