【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学，具体的说一种挖掘和鉴定生殖干细胞的标记基因的方法。
技术介绍
1、精原干细胞是雄性体内唯一能将遗传信息传递给下一代的成体干细胞，既能自我更新保持干性又能定向分化为成熟精子，此过程受到周围各种细胞、基质及细胞因子等微环境的精确调控。目前有关精原干细胞在人类、小鼠以及其他哺乳类报道相对较多，而在鱼类精原干细胞的研究很少，其主要原因之一就是缺乏明确的精原干细胞标记基因，因此对精原干细胞的标记、分离以及培养等研究都远远滞后于哺乳类动物。
技术实现思路
1、本专利技术目的在于提供一种鉴定生殖干细胞的标记基因的方法。
2、为实现上述目的，本专利技术采用技术方案为：
3、一种鉴定生殖干细胞的标记基因的方法，利用酶消化法获得鉴定对象精巢内所有细胞，通过单细胞转录组测序获得所分离的所有细胞的转录信息，然后通过细胞分群和再分群，拟时分析、候选生殖细胞标记基因重定位方式，确定生殖干细胞所属细胞群，获取该细胞群的top基因，最终通过原位杂交进一步验证所获得的标记基因即为生殖干细胞标记基因。
4、将获得精巢去除外膜并剪成浆状，采用酶解液对其进行消化去除精巢结缔组织，收集活体细胞，并进行单个细胞裂解、标记、扩增和单细胞rna测序。
5、所述酶解液体系为：用ph7.5pbs配置，胶原蛋白酶h 4-6mg/ml、5-10％胎牛血清(质量比)、0.05-0.1％dnasei(质量比)。
6、根据单细胞rna测序通过seurat包中
7、所述通过两次分群后所获得的细胞群的基因集top10基因，取交集获得候选的生殖干细胞标记基因。
8、所述将两次分群筛选出标记基因集的top基因通过featureplot函数将其重新定位在高精度细胞分群图谱，进而确定所筛选基因为生殖干细胞标记基因。
9、利用monocle函数对获得生殖干细胞标记基因再次进行拟时分析，并将细胞定位在2维空间的拟时间轴上，通过nanos2确定细胞发育轨迹时间起点，而后进一步再进一步通过原位杂交进一步验证所得获得基因即为生殖干细胞标记基因。
10、对获得生殖干细胞标记基因再次在拟时发育轨迹上进行定位，其原理是：由于干细胞是生殖细胞发育的起始细胞，如果是生殖干细胞标记基因其正确的分布位置应定位在细胞轨迹初始区域，代表生殖细胞分发育的起始，只有与细胞拟时分析轨迹高度吻合的标记基因方可证明为生殖干细胞标记基因。因此我们将筛选的生殖干细胞标记基因再次将其定位在拟时轨迹的起始区域，从而证明其为干细胞的真实性。
11、本专利技术所具有的优点：
12、本专利技术鉴定生殖干细胞的新标记基因的方法，该方法可准确、快速鉴定鱼类精巢种的生殖干细胞，为鱼类生殖干细胞的分离、种质细胞的保存、保护以及细胞育种提供了新方法；具体为：
13、1.快速，通过单细胞测序可以在顿时间内分离、鉴定生殖干细胞的标记基因；
14、2.精准，目标基因可以定位在所在细胞群且细胞数量大，因此筛选方法比传统实验手段更精准；
15、3.批量，单细胞测序一次可达上万个细胞，每个细胞可测量几千个基因，因此通过此技术可批量以获得目标基因。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种鉴定生殖干细胞的标记基因的方法，其特征在于：利用酶消化法获得鉴定对象精巢内所有细胞，通过单细胞转录组测序获得所分离的所有细胞的转录信息，然后通过细胞分群和再分群，拟时分析、候选生殖细胞标记基因重定位方式，确定生殖干细胞所属细胞群，获取该细胞群的top基因，最终通过原位杂交进一步验证所得即为生殖干细胞标记基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将获得精巢去除外膜并剪成浆状，采用酶解液对其进行消化去除精巢结缔组织，收集活体细胞，并进行单个细胞裂解、标记、扩增和单细胞RNA测序。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述酶解液体系为：用PH7.5PBS配置，胶原蛋白酶H 4-6mg/ml、5-10％胎牛血清(质量比)、0.05-0.1％DNaseI(质量比)。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：根据单细胞RNA测序通过Seurat包中FindNeighbors和FindCluster函数分别将dims值设置到20-50，r值设置到最大阈值0.5-1.4，进行高精度分群，然后利用生殖干细胞标记基因nanos2，明确干细胞
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于：所述通过两次分群后所获得的细胞群的基因集top10基因，取交集获得候选的生殖干细胞标记基因。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述将两次分群筛选出标记基因集的top基因通过FeaturePlot函数将其重新定位在高精度细胞分群图谱，进而确定所筛选基因为生殖干细胞标记基因。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：利用monocle函数对获得生殖干细胞标记基因再次进行拟时分析，并将细胞定位在2维空间的拟时间轴上，通过nanos2确定细胞发育轨迹时间起点，而后进一步再进一步通过原位杂交进一步验证所得即为生殖干细胞标记基因。
...【技术特征摘要】
1.一种鉴定生殖干细胞的标记基因的方法，其特征在于：利用酶消化法获得鉴定对象精巢内所有细胞，通过单细胞转录组测序获得所分离的所有细胞的转录信息，然后通过细胞分群和再分群，拟时分析、候选生殖细胞标记基因重定位方式，确定生殖干细胞所属细胞群，获取该细胞群的top基因，最终通过原位杂交进一步验证所得即为生殖干细胞标记基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将获得精巢去除外膜并剪成浆状，采用酶解液对其进行消化去除精巢结缔组织，收集活体细胞，并进行单个细胞裂解、标记、扩增和单细胞rna测序。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述酶解液体系为：用ph7.5pbs配置，胶原蛋白酶h 4-6mg/ml、5-10％胎牛血清(质量比)、0.05-0.1％dnasei(质量比)。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：根据单细胞rna测序通过seurat包中findneighbors和findcluster函数分别将dims值设置到20-50，r值设置到最大阈值0.5-1.4，进行高精度分群，然后利用生殖干细胞标记基因nanos2，明确干细胞所属的细胞群位置，...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘清华，李军，段蕾，张艺超，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：
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