应用伴刀豆凝集素材料富集糖蛋白或糖肽中聚糖的方法技术

本发明专利技术涉及凝集素亲和材料的应用领域，以改性的硅胶为基质，以伴刀豆Con A为配基，制备出SG Con A材料，根据凝集素和聚糖化合物的可逆性结合作用富集糖蛋白/糖肽，将富集得到的糖蛋白/糖肽经过酶解释放聚糖，经过富集得到聚糖，结合质谱的方法鉴定聚糖的结构和构型。本发明专利技术应用亲和固定相富集聚糖化合物，可在高效液相色谱模式和固定相萃取两种模式下分别富集糖蛋白或者糖肽，并且可将此方法应用于实际样品中聚糖化合物的分离和鉴定。

【技术实现步骤摘要】
应用伴刀豆凝集素材料富集糖蛋白或糖肽中聚糖的方法
本专利技术涉及凝集素亲和材料应用
，涉及到以硅胶为基质，伴刀豆凝集素concanavalinA(ConA)为配基的亲和材料SGConA的制备，以标准糖蛋白和糖肽为富集对象，评价SGConA的基本性质，应用SGConA制备ovalbumin糖蛋白或者糖蛋白经过胰蛋白酶(trypsin)酶解得到的糖肽，并用内切糖苷酶PNGaseF(切除与天冬酰胺Asn相连的聚糖和糖蛋白/糖肽)，酶解糖蛋白/糖肽，释放糖链，经过富集得到聚糖，结合质谱表征的方法鉴定聚糖的结构，并将此评价方法应用于富集实际样品中的糖蛋白或者糖肽。
技术介绍
凝集素(Lectin)是指一种从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，可以特异性的识别聚糖或者含有聚糖的糖蛋白或者糖肽，并被认为是破译聚糖构型的密码子(L.Albert,N.Miyako,H.Marina,H.WilliamS.,TheLectinRiddle:GlycoproteinsFractionatedfromComplexMixturesHaveSimilarGlycomicProfiles，AJournalofIntegrativeBiology,14(2010)487-499.)。因此凝集素亲和色谱广泛应用于糖蛋白糖肽的富集中，在蛋白质组学的分析中，多种凝集素连用的技术在复杂样品的分析中发挥着卓越的功能(P.Tatiana,W.Eric,H.WilliamS.,H.Marina,Combinationofabundantproteindepletionandmulti-lectinaffinitychromatography(M-LAC)forplasmaproteinbiomarkerdiscovery,J.ProteomeRes.,6(2007)662–671.；G.FranciscaO.,H.BrianB.,P.Katie,G.Carolina,H.Marina,H,WilliamS.,CharacterizationofGlycoproteinsinPancreaticCystFluidUsingaHigh-PerformanceMultipleLectinAffinityChromatographyPlatform，J.ProteomeRes.,13(2014)289–299.)。在蛋白质的富集策略中，存在自上而下(从蛋白质水平)和自下而上(糖肽水平)两种富集策略，即使富集后的糖蛋白经过酶解后仍然存在着大量的非糖肽，使得应用自下而上的富集策略更为广泛(S.Bingyun,R.JeffreyA.,U.AngelitaG.,W.JamesT.,Y.Xiaowei,L.Biaoyang,H.Leroy,ShotgunGlycopeptideCaptureApproachCoupledwithMassSpectrometryforComprehensiveGlycoproteomics，MolCellProteomics，6(2007)141-149.)。在糖肽的质谱鉴定中，由于高强度非糖肽信号峰的存在，严重抑制了糖肽的分子离子峰的强度，从而衍生出很多的富集材料和富集方法以提高糖肽的检测效率。除了凝集素亲和色谱方法外，广为流行的富集方法有肼化学法(Z.Lijuan,J.Hucong,Y.Jun,W.Yali,F.Caiyun,Y.Pengyuan,L.Haojie,HighlyspecificenrichmentofN-linkedglycopeptidesbasedonhydrazidefunctionalizedsolublenanopolymers,chem.commun.,50(2014)1027-1029.)。硼酸亲和色谱法(Boronateaffinitychromatography.2000.119-128.)。亲水色谱法(Y.Long,L.Xiuling,G.Zhimou,Z.Xiuli,L.Xinmiao,Hydrophilicinteractionchromatographybasedenrichmentofglycopeptidesbyusingclickmaltose:Amatrixwithhighselectivityandglycosylationheterogeneitycoverage.Chemistry-AEuropeanJournal,15(2009)12618-12626.)。肼化学法是利用固定于基质上的肼官能团和经高碘酸钠氧化聚糖得到的醛基反应生成Shiff-base的方法,将聚糖化合物(糖蛋白或者糖肽)固定于基质上，与非聚糖化合物分离，并再次通过PNGaseF酶切聚糖，从基质上释放出蛋白质或者肽；此方法的优点是可以快速的鉴定出糖蛋白或者糖肽的糖基化位点，缺点是聚糖被氧化，从而破坏了其构型，不能实现对聚糖构型的解析；硼亲和色谱富集糖蛋白是应用硼酸在酸性条件下和聚糖化合物的邻二醇可逆性结合，在碱性条件下与聚糖化合物分离的原理实现对糖蛋白糖肽的捕获，该方法的缺点在于硼酸和聚糖化合物中的邻二醇的结合力十分弱，在富集过程中遗漏部分糖蛋白和糖肽；亲水色谱由于其对糖化合物的亲水作用，被广泛应用于糖肽的富集中，但此种方法的批次重复性不高；虽然凝集素亲和色谱和聚糖的结合力不是十分强，由于凝集素对特定构型的聚糖化合物的特异性识别能力仍备受青睐，并被广泛应用于蛋白质组学的研究中。硅胶基质本身具有亲水性，机械强度高和易于修饰的优点，我们选取硅胶基质的凝集素亲和材料，评价其基本性质，优化富集条件，在高效液相色谱(HPLC)模式下选择性的富集糖蛋白和糖肽，其优点是操作简单快捷，所用试剂为环境友好型试剂，经济且环保，并能够高通量的应用于含有糖蛋白的药物纯化制备中；而对于微量的糖肽，也可以在SPE模式下应用此方法富集糖肽，结合质谱表征，鉴定出肽段异常糖基化的聚糖结构，半个小时以内即可得到结果，此检测方法方便快捷有效。
技术实现思路
为了更有效的富集糖肽，我们应用凝集素亲和材料分别采用自上而下(糖蛋白质水平)和自下而上(糖肽水平)的两种富集策略富集糖蛋白或者糖肽；在自上而下(糖蛋白质水平)的富集过程中，将富集得到的糖蛋白分别经过PNGaseF酶切或者胰蛋白酶(trypsin)酶解并PNGaseF酶切释放糖链；在自下而上(糖肽水平)的富集过程中，糖蛋白首先经过胰蛋白酶(trypsin)酶解得到糖肽，经过凝集素亲和材料富集糖肽后再用PNGaseF酶酶切释放糖链；通过亲水材料富集两种策略中释放的糖链，并结合质谱QTOF-ESI-MS的方法鉴定聚糖的结构；此种方法依据凝集素和聚糖的特异性识别作用，用于富集实际样品中的糖蛋白或者糖肽，丰富了凝集素亲和色谱在蛋白质组学研究中的应用。应用方法如下：以经过化学改性的硅胶为基质，伴刀豆凝集素concanavalinA(ConA)为配基，制备硅胶凝集素亲和材料SGConA；其制备特征为：a.硅胶预处理：用酸溶液处理硅胶，活化硅胶表面的羟基；b.含有双官能团间隔臂的制备:在惰气气氛保护下，室温，将氨丙基烷氧基硅烷溶于非质子极性溶剂中，加入双官能团试剂，电磁本文档来自技高网...

【技术保护点】
应用伴刀豆凝集素材料富集糖蛋白或糖肽中聚糖的方法，步骤如下：a.以经过化学改性的硅胶为基质，伴刀豆凝集素concanavalin A(Con A)为配基，制备硅胶凝集素亲和材料SG Con A；b.将凝集素亲和材料SG Con A装填为色谱柱，在高效液相色谱模式下，样品中的糖蛋白或糖肽的色谱富集条件，淋洗液和洗脱液pH值5‑8，盐浓度0.01‑1.0M，温度4‑60℃；c.制备糖蛋白/糖肽：将所得糖蛋白或糖肽馏分经过脱盐，PNGase F酶解、或trypsin酶解脱盐后再经过PNGase F酶解释放出糖链，并再次脱盐，应用亲水性材料富集聚糖。

【技术特征摘要】
1.应用伴刀豆凝集素材料富集糖蛋白或糖肽中聚糖的方法，步骤如下：a.以经过化学改性的硅胶为基质，伴刀豆凝集素concanavalinA(ConA)为配基，制备硅胶凝集素亲和材料SGConA；b.将硅胶凝集素亲和材料SGConA装填为色谱柱，在高效液相色谱模式下，样品中的糖蛋白或糖肽的色谱富集条件，淋洗液和洗脱液pH值5-8，盐浓度0.01-1.0M，温度4-60℃；所述步骤b:其中ConA特异性结合甘露糖型和葡萄糖型的聚糖，不结合复杂型的聚糖，同时对高甘露糖型有特异性强结合，以不含有糖的人血清蛋白(HSA),含有高甘露糖型的核糖胰蛋白酶B(RNaseB)和含有复合糖型的鸡卵清糖蛋白(ovalbumin)作为色谱评价对象，评价凝集素亲和材料的富集性能；所述色谱富集条件为：1）为淋洗液为A相，洗脱液为B相，温度为4-60℃，0-10min,100%A,10-12min,0-100%B,12-22min,100%B,22-25min,0-100%C,25-35min,100%C,35-37min,0-100%A,37-45min,100%A；淋洗液A相为磷酸盐(PBS)缓冲溶液，并含有0.01M-1M的NaCl，0.01-50mMCaCl2,0.01-50mMMgCl2,0.01-50mMMnCl2,pH5-8；洗脱液B为含有0.01M-1.0M竞争性糖的缓冲溶液，竞争性洗脱试剂为甲基-α-吡喃甘露糖或者甲基-α-吡喃葡萄糖，糖的浓度0.01-1.0M，并含有0.01M-1M的NaCl，0.01-50mMCaCl2,0.01-50mMMgCl2,0.01-50mMMnCl2,pH值5-8；或2）为:取亲和材料SGConA1-2mg，装填于Zip-tip小柱中，淋洗液为A相；洗脱液为B相，取糖肽1-10μg，经过A溶液的上样、淋洗和B溶液的洗脱,分别收集上样液、淋洗液和洗脱液;所述淋洗液A相为磷酸盐(PBS)缓冲溶液，并含有0.01M-1.0M的NaCl，1-10mMCaCl2,1-10mMMgCl2,1-10mMMnCl2,pH5-8；所述洗脱液B相为含有0.01M-1.0M竞争性糖的磷酸盐缓冲溶液,竞争性糖为甲基-α-吡喃甘露糖或者甲基-α-吡喃葡萄糖；c.制备糖蛋白/糖肽：将所得糖蛋白或糖肽馏分经过脱盐，PNGaseF酶解、或trypsin酶解脱盐后再经过PNGaseF酶解释放出糖链，并再次脱盐，应用亲水性材料富集聚糖；步骤c中脱盐过程为：1）.用透析袋透析脱盐，透析袋截留糖蛋白的分子量1000-20000Da；或2）.应用反相色谱柱脱盐，流动相条件:反相C18色谱柱，100-500Å，5-50μm，A相为水含有0.1%甲酸(FA)，B相为乙腈含有0.1%甲酸(FA),洗脱梯度为1-10min,100%A,10-20min,80%B体积浓度,接收10min以后的馏分，将所接馏分离心浓缩后，低温保存。2.按照权利要求1所述的方法制备SGConA材料，其特征在于：步骤a：经过化学改性的硅胶含有一定碳链长...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘玉洁，梁鑫淼，于龙，付冬梅，肖远胜，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21