一种包被蛋白G的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种苏丹红Ⅰ免疫亲和柱，包括载体、蛋白G和苏丹红Ⅰ抗体，其中，所述蛋白G通过化学键偶联在载体上，所述苏丹红Ⅰ抗体与蛋白G结合后用交联剂交联。其中，所述蛋白G为基于GenBank CAA27638.1经过基因重组表达的重组蛋白G。本发明专利技术在不影响检测性能的条件下，先经蛋白G预处理的琼脂糖凝胶载体苏丹红Ⅰ抗体的需用量约为直接偶联法制备净化柱填料的抗体的需用量的四分之三。使用本发明专利技术得到的苏丹红Ⅰ纯度很高，后续不用再做别的纯化处理就可以直接用于高效液相色谱检测，节省了操作者的时间和费用。

Sudan red I immunoaffinity column coated with protein G and preparation method thereof

The invention provides a tonyred of immunoaffinity column, including carrier, protein G and tonyred I antibody, wherein the protein G chemically conjugated to the carrier, the tonyred I antibody and protein G combined with crosslinking agent. Among them, the protein G GenBank CAA27638.1 after recombinant gene expression of recombinant protein based on G. The invention does not affect the detection performance under the condition of the first required amount of protein G pretreatment of agarose gel carrier tonyred I antibody to antibody dosage is about preparation of direct coupling of the 3/4 purification column packing. The Sudan Sudan I obtained by the invention has high purity and can be directly used for high performance liquid chromatography detection without further purification treatment, thereby saving time and cost of the operator.

【技术实现步骤摘要】
一种包被蛋白G的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱及其制备方法
本专利技术属于食品检验领域，具体涉及一种包被蛋白G的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱及其制备方法。
技术介绍
苏丹红是一种人工合成的偶氮类、油溶性的化工染色剂，1896年科学家达迪将其命名为苏丹红并沿用至今。苏丹红被大量地用在生物、化学等领域，用于机油、汽车蜡和鞋油等工业产品。随着人们对苏丹红结构及致毒性的逐步了解，国际癌症研究机构(IARC)将苏丹红归为第3类可致癌物质，这类物质虽缺乏足够的直接使人类致癌的证据，但是具有潜在的致癌危险。苏丹红为亲脂性偶氮化合物，外观呈暗红色或深黄色片状晶体，难溶于水，主要包括Ⅰ、Ⅱ、III和Ⅳ4种类型。其中II、III和IV均为I的化学衍生物。SudanⅠ在体内的代谢产物为苯胺和1-氨基-2-萘酚。苯胺是制造染料、橡胶促进剂及抗氧剂等的原料，是一种重要的有机合成中间体。然而一旦苯胺接触人体皮肤或进入消化系统以后，一方面由于苯胺可直接作用于肝细胞，引起中毒性肝病，还有可能诱发肝脏细胞基因发生变异，增加了人体癌变的几率；另一方面，有可能因为苯胺将血红蛋白结合的Fe(Ⅱ)氧化为Fe(Ⅲ)，导致血红蛋白无法结合氧而患上高铁血红蛋白症。另据报道，长期摄入苯胺还可造成人体的神经系统损害。在饲料中违规添加苏丹红也严重影响人们的身体健康，影响畜牧业的正常发展。目前苏丹红常用的检测方法有薄层层析法(TLC)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)及液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)等。酶联免疫吸附试验(ELISA)具有高效、灵敏、可采样后经简单处理直接进行检测等优点，但该方法也存在假阳性率偏高的缺点。HPLC、LC-MS/MS法是定量分析苏丹红最常用的方法。使用液相或液质方法检测时，为减少杂质干扰，降低其对检测效果的影响，需要先对各种不同基质的样品进行净化处理。目前常用的净化处理方法就是固相萃取法，也叫柱层析法。是目前净化使用最广泛的方法。其中，免疫亲和柱方法的分析速度快，灵敏度高，分离效率和回收率高，安全可靠，因而成为最常用的方法。用于目前制备免疫亲和纯化柱的方法大概有：溴化氰活化直接偶联法、环氧氯丙烷法、过碘酸钠法等。这些方法的基本原理都是将载体基质进行化学活化后，将抗体偶联到载体上；蛋白G(ProteinG)是从链球菌A、C和G群很多菌株的细胞壁及培养上清中提取的能与IgGFc片段特异性结合的蛋白，该蛋白能特异性的与多种动物抗体的Fc部位相结合，且具有很高的亲和力。虽然使用蛋白G具有高亲和力，但使用蛋白G处理的载体会降低亲和层析柱的洗脱速度，从而降低抗体的利用率与检测的效率。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的第一目的在于提供一种苏丹红Ⅰ免疫亲和柱，包括载体、蛋白G和苏丹红Ⅰ抗体，其中，所述蛋白G通过化学键偶联在载体上，所述苏丹红Ⅰ抗体与蛋白G结合后用交联剂交联。优选地，本专利技术所述的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱中，所述蛋白G包括按照GenBankCAA27638.1序列表达的蛋白G，以及经过基因重组表达的重组蛋白G。优选地，本专利技术所述的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱中，所述蛋白G为基于GenBankCAA27638.1经过基因重组表达的重组蛋白G。优选地，本专利技术所述的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱中，所述蛋白G通过化学键偶联在载体上，苏丹红Ⅰ抗体与蛋白G结合后用交联剂交联。优选地，本专利技术所述的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱中，所述的基因重组表达的重组蛋白G，包括降低了载体-重组蛋白G空间位阻作用，增加了重组蛋白G与苏丹红Ⅰ抗体IgG的结合能力的优化。优选地，本专利技术所述的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱中，所述重组蛋白G优化位点为截除GenBankCAA27638.1序列N端53个氨基酸。优选地，本专利技术所述的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱中，所述的载体是琼脂糖凝胶；所述的琼脂糖凝胶包括溴化氰活化的琼脂糖凝胶、交联的琼脂糖凝胶、聚丙烯酸琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶以及纤维素的一种或几种；更优选地，所述载体为琼脂糖Sepharose4B。优选地，本专利技术所述的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱中，所述的抗苏丹红Ⅰ抗体包括单克隆IgG抗体和多克隆抗体。本专利技术的另一目的在于提供一种苏丹红Ⅰ免疫亲和柱的制备方法，包括以下步骤：1)载体活化；2)重组蛋白G与活化的载体进行偶联；3)处理载体-重组蛋白G，并与苏丹红Ⅰ抗体偶联；4)洗涤苏丹红Ⅰ抗体-重组蛋白G-载体，装柱即获得苏丹红Ⅰ免疫亲和柱。优选地，本专利技术所述的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱的制备方法中，包括以下步骤：1)琼脂糖Sepharose4B，加入0.8M的NaOH，30％的环氧氯丙烷，2mg/ml的硼氢化钠NaBH4,在25℃下摇床反应8h进行活化；2)每克活化的Sepharose4B加入30～200nmol的重组蛋白G，在0.1MNaHCO3，0.5MNaClpH8.8的缓冲液中，室温偶联2h，或者4℃偶联过夜；3)偶联产物用1MTris·HClpH8.0室温反应2h；4)偶联好的Sepharose-蛋白G，用20mMpH7.4的PBS洗涤；5)将苏丹红Ⅰ抗体溶解在20mMpH7.4的PBS中，每克蛋白G-Sepharose加入200nmol～1.2umol抗体，室温反应30分钟；6)将苏丹红Ⅰ抗体-蛋白G-Sepharose载体用20mMPBSpH7.4洗涤，然后加入终浓度0.2M的三乙醇胺和20mM的二甲基庚二酸酯(DMP)，pH8.3，室温反应1h；7)用20mMpH7.4的乙醇胺终止反应，用含有0.01％硫柳汞的10mMPBSpH7.4洗涤苏丹红Ⅰ抗体-蛋白G-Sepharose载体，装柱，放于4℃保存；其中，所述重组蛋白G为基于GenBankCAA27638.1经过基因重组表达的重组蛋白G。由上可知，本专利技术至少具有以下优点：1)我们克隆重组了蛋白G(GenBankCAA27638.1)的基因序列，在大肠杆菌中表达出了与抗体有高亲和力的基因重组蛋白G。利用了蛋白G与Ig抗体特异性结合的特点，IgG抗体由两条重链和两条轻链构成，抗体分为Fab区和Fc区，其中，Fab区是抗原结合的区域。蛋白G是链球菌细胞壁上的一种特殊的蛋白，与抗体的Fc区域有特异性的结合能力。蛋白G与抗体结合后，抗体的Fab区域游离在外，不影响抗体的抗原结合能力。经过我们基因优化重组后的蛋白G，1个分子的蛋白G可以结合3个分子的IgG抗体，具有很高的抗体亲和力。并且只有抗体能与蛋白G结合，其余蛋白均不能与蛋白G结合，特异性很高。以此蛋白G为基础制备的免疫亲和柱具有特异性好，苏丹红Ⅰ结合量大，纯化效率高的特点。将基因重组的蛋白G偶联到琼脂糖载体上后，再进行苏丹红Ⅰ抗体偶联，与传统的直接偶联相比，以基因重组的蛋白G为中间间臂偶联到载体上后，降低了空间位阻作用，增加了重组蛋白G与苏丹红Ⅰ抗体IgG的结合能力，使杂质能够充分的流出，增强了净化效果，从而使抗体的Fab端朝向外侧，空间位阻不对抗原结合区域构成干扰，将载体先经蛋白G处理后，再进行抗体偶联，不仅可提高不同净化柱间的均一性，而且能提高抗体的利用率。因此，通过设计重组蛋白G使其与IgG抗体特异性结合，使抗体通过蛋白G偶联到载体上。并且使得IgG抗体的Fab片段充分的暴露在外，大幅度提高了苏丹红Ⅰ的捕获能力，苏丹红Ⅰ的纯化效率也得到本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种苏丹红Ⅰ免疫亲和柱，包括载体、蛋白G和苏丹红Ⅰ抗体，其特征在于，所述蛋白G通过化学键偶联在载体上，所述苏丹红Ⅰ抗体与蛋白G结合后用交联剂交联。

【技术特征摘要】
1.一种苏丹红Ⅰ免疫亲和柱，包括载体、蛋白G和苏丹红Ⅰ抗体，其特征在于，所述蛋白G通过化学键偶联在载体上，所述苏丹红Ⅰ抗体与蛋白G结合后用交联剂交联。2.根据权利要求1所述的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱，其特征在于，所述蛋白G包括按照GenBankCAA27638.1序列表达的蛋白G，以及经过基因重组表达的重组蛋白G。3.根据权利要求2所述的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱，其特征在于，所述蛋白G为基于GenBankCAA27638.1经过基因重组表达的重组蛋白G。4.根据权利要求1～3中所述的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱，其特征在于，所述蛋白G通过化学键偶联在载体上，苏丹红Ⅰ抗体与蛋白G结合后用交联剂交联。5.根据权利要求3中所述的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱，其特征在于，所述的基因重组表达的重组蛋白G，包括降低了载体-重组蛋白G空间位阻作用，增加了重组蛋白G与苏丹红Ⅰ抗体IgG的结合能力的优化。6.根据权利要求3中所述的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱，其特征在于，所述重组蛋白G优化位点为截除GenBankCAA27638.1序列N端53个氨基酸。7.根据权利要求1中所述的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱，其特征在于，所述的载体是琼脂糖凝胶；所述的琼脂糖凝胶包括溴化氰活化的琼脂糖凝胶、交联的琼脂糖凝胶、聚丙烯酸琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶以及纤维素的一种或几种。8.根据权利要求1中所述的苏丹红Ⅰ免疫亲和柱，其特征在于所述的抗苏丹红Ⅰ抗体包括单克隆IgG抗体和多克隆抗体。9.一种苏丹红Ⅰ免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)载体活化...

【专利技术属性】
技术研发人员：董颖超，秦玉昌，李军国，刘士杰，谷旭，单耕，柳家鹏，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11