一种一次制备多个DNA大片段插入双末端测序文库的方法技术

本发明专利技术提供了一种一次制备多个DNA大片段插入双末端测序文库的方法，包括以下步骤：将待测DNA打断后进行生物素接头标记处理；将生物素标记的DNA片段分选成N个不同大小的DNA片段，其中，10≤N≤12；将所述N个不同大小的DNA片段分别进行环化处理得到环状DNA，然后清除未环化的线性DNA片段，将所述环状DNA打断后连接上带有不同索引序列的Truseq接头；将带有Truseq接头的不同长度的DNA片段混合并与链霉亲和素磁珠反应，富集带有生物素标记的DNA片段；PCR扩增所述带有生物素标记的DNA片段并测序。

【技术实现步骤摘要】
一种一次制备多个DNA大片段插入双末端测序文库的方法
本专利技术属于分子生物学领域，尤其涉及一种一次制备多个DNA大片段插入双末端测序文库(N-Size-FragmentMatePairLibrary,NSF-MPLibrary)的方法。
技术介绍
大片段插入文库(Mate-pairedlibrary)在基因组研究中扮演着重要的角色，在基因组从头测序中，大片段插入文库可以为基因组的组装提供骨架，提高基因组组装的精确度和质量。目前完成的大的全基因组从头测序全是由几个不同大小插入片段(比如200bp，400bp)的小片段文库(shotgunlibrary)和大片段文库(2kb，5kb，10kb和20kb)组成。利用小片段文库的read组装contig，然后利用大片段文库的read将contig组装成scaffold。此外，大片段插入文库还可以提高read在基因组重复区域的定位效率。在基因组重测序中，大片段插入文库可以用来高效的检测基因组结构变异。然而，由于技术和成本的限制，目前大片段插入测序文库在基因组测序的研究和应用上尚未被广泛利用。目前，有多种方法可用于DNA大片段插入文库的构建。这些方法都建立在相同的思路之上。第一，将基因组DNA打断成不同长度的片段(一般为2-20kb)；第二，选择一定长度范围的DNA片段(比如3-5kb，9-11kb，15-20kb等)；第三，将选择的DNA片段环化连接，并在接合处引入带生物素修饰的碱基；第四，打断环状DNA分子，并用链霉亲和素磁珠(streptavidinbead)富集含有生物素的片段；第五，将富集出来的含有生物素的片段连接测序接头并测序。现有构建DNA大片段插入文库的方法，其区别主要在于环化方法的不同。Illimina公司生产的MatePairLibraryv2kit将打断的DNA直接通过末端修复(endrepair)转化成平末端片段并在末端修复的过程中引入带生物素修饰的碱基，然后，被修复的DNA分子直接利用T4DNA连接酶而环化。此方法的缺点是环化DNA分子的接合处无已知接头序列，因此测序后无法直接鉴定该read是mate-pairedread还是shotgunread，给后续生物信息学分析带来很大不便。LifeTechnology公司生产的5500SOLiDTMMate-PairedLibraryKit(Catalognumber:4464418)先将选择的DNA片段连接上一个带有粘性末端(stickend)的MP接头，然后再通过一个带有生物素的中间接头通过DNA退火杂交而将DNA分子两端的两个MP接头连接在一起成环。罗氏公司(RocheDiagnostics)的GSFLXPairedEndDNALibraryPreparationkit则先将选择的DNA片段两端连接上含有cre酶靶位点的接头，然后利用cre酶将DNA片段环化。Illumina生产的另外一种制备大片段文库的Nexteramatepairkit利用Tn5转座酶介导的转座特性，可以再打断基因组DNA的同时，将接头加在DNA上，然后，环化选择的DNA片段。这些方法共同的缺点在于，由于DNA片段选择这一步需要选择比较窄的范围的DNA，而目前的打断基因组DNA的方法都只能将基因组DNA打断成5-15kb的smear，因此，80％-90％的DNA在DNA片段选择这一步被浪费掉了，导致这些方法需要10μg以上的起始DNA材料才能满足要求。相比较而言，IlluminaNexteramatepairkit是目前最好的mate-paired测序文库构建的试剂盒。然而，由于其构建DNA大片段插入文库的过程中，利用切胶回收的方法选择回收一定范围(比如8-10kb)的DNA片段并利用T4DNA连接酶将选择的DNA片段环化，因此，IlluminaNexteramatepairkit仍然未解决DNA大片段插入文库在DNA片段筛选步骤中大量DNA被浪费的缺点。此外，由于不同长度的插入片段在做基因组从头组装和检测基因组结构变异时的功能不同，在实际应用中，对同一份DNA样品常常需要构建数个不同插入长度的大片段文库，不仅增加了建库的成本，而且需求的DNA量也提高了，限制了大片段文库在基因组研究中的广泛应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种一次制备多个DNA大片段插入双末端测序文库的方法，旨在解决现有技术的如下缺陷：第一，仅能一次制备包含一个插入片段长度的大片段双末端测序文库，在实际应用中，当需要不同插入长度的大片段文库时，需要多次制备；第二，同一份DNA样品在构建不同插入长度的大片段文库时，往往只回收一个目的片段(仅占DNA总量的10-20％)，造成大量DNA样品的浪费。本方法可以一次制备包含多个不同长度插入片段的大片段双末端测序文库，不仅大大降低了大片段文库的建库试剂成本和人工成本，而且避免了DNA样品在片段选择步骤的浪费，降低了DNA样品的需要量。本专利技术是这样实现的，一种一次制备多个DNA大片段插入双末端测序文库的方法，包括以下步骤：将待测DNA打断并进行生物素接头标记处理，得到生物素标记的DNA片段；将所述生物素标记的DNA片段分选成N个不同大小的DNA片段，其中，10≤N≤12；将所述N个不同大小的DNA片段分别进行环化处理得到环状DNA；然后清除未环化的线性DNA片段；将所述环状DNA打断后连接上带有不同barcode的Truseq接头，得到含有不同Truseqbarcode接头的DNA片段；将所述带有Truseqbarcode接头的DNA片段与链霉亲和素磁珠反应，富集带有生物素标记的DNA片段；PCR扩增所述带有生物素标记的DNA片段并测序。本专利技术提供的制备包含多个不同长度插入片段的双末端测序文库的方法，将打断后的DNA分选成不同长度的片段，能一次制备获得多达10个以上不同插入长度的DNA大片段文库，并能将10个以上不同插入长度的大片段文库整合在一个测序文库中，对建库而言，通过将多个不同长度插入片段的大片段文库整合在一个文库中，大大降低了建库成本，而且避免了DNA样品在片段选择步骤中的浪费，降低了DNA样品的需要量，对临床样品和珍贵样品中有重要的意义；对后续分析而言，不同插入长度的大片段文库可以为基因组的从头组装和重测序提供不同的信息和更准确的结果，在基因组的从头组装和通过重测序鉴定各种不同类型的遗传变异(包括SNP和小的indel，尤其是大的基因组结构变异如插入、缺失、倒置、异位等)方面具有重要的应用前景。附图说明图1是本专利技术实施例提供的制备包含多个不同长度插入片段的双末端测序文库的流程示意图；图2是本专利技术实施例1提供的包含11个片段的大片段文库插入片段长度分布图；图3是本专利技术对比例1提供的只有一个长度的大片段文库插入片段长度分布图；图4是本专利技术对比例2提供的只有一个长度的大片段文库插入片段长度分布图。具体实施方式为了使本专利技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。一种一次制备多个DNA大片段插入双末端测序文库的方法，包括以下步骤，如附图1所示：S01.将待测DNA打断并连接本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种一次制备多个DNA大片段插入双末端测序文库的方法，包括以下步骤：将待测DNA打断后连接上带有生物素的DNA接头，得到生物素标记的DNA片段；将所述生物素标记的DNA片段分选成N个不同大小的DNA片段，其中，10≤N≤12；将所述N个不同大小的DNA片段分别进行环化处理得到环状DNA；然后清除未环化的线性DNA片段；将所述环状DNA打断后连接上带有不同barcode的Truseq接头，得到含有不同Truseq barcode接头的DNA片段；将所述带有Truseq barcode接头的DNA片段混合，并与链霉亲和素磁珠反应，富集带有生物素标记的DNA片段；PCR扩增所述带有生物素标记的DNA片段并测序。

【技术特征摘要】
1.一种一次制备多个DNA大片段插入双末端测序文库的方法，包括以下步骤：将待测DNA打断后连接上带有生物素的DNA接头，得到生物素标记的DNA片段；将所述生物素标记的DNA片段分选成N个不同大小的DNA片段，其中，10≤N≤12，所述将待测DNA打断的步骤中，采用Tn5转座酶复合体将待测DNA打断并加上带有生物素修饰的DNA接头，且所述Tn5转座酶复合体和所述待测DNA的比例为3-5.5μLTn5转座酶复合体：1μg待测基因组DNA；将所述N个不同大小的DNA片段分别进行环化处理得到环状DNA；然后清除未环化的线性DNA片段；将所述环状DNA打断后连接上带有不同barcode的Truseq接头，得到含有不同Truseqbarcode接头的DNA片段；将所述带有Truseqbarcode接头的DNA片段混合，并与链霉亲和素磁珠反应，富集带有生物素标记的DNA片段；PCR扩增所述带有生物素标记的DNA片段并测序。2.如权利要求1所述的一次制备多个DNA大片段插入双末端测序文库的方法，其特征在于，对所述生物素标记的DNA片段进行片段分选采用SAGEScience公司的SAGEELF实现，具体方法为：将生物素标记的DNA片段和加样缓冲液...

【专利技术属性】
技术研发人员：常玉晓，
申请(专利权)人：中国农业科学院深圳农业基因组研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44