高通量测序文库及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种高通量测序文库及其构建方法。该方法包括：S1，用引物混合物进行多重PCR得到多个目标片段；S2，对多个目标片段接头连接得到多个带接头的目标片段；和S3，对多个带接头的目标片段进行乳液PCR得到高通量测序文库；引物混合物为cDNA引物混合物和/或DNA引物混合物；cDNA引物混合物包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示第1对引物以及SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示第2对引物；DNA引物混合物包括SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示第3对引物以及SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示第4对引物。该方法可有效提高检测通量。

【技术实现步骤摘要】
高通量测序文库及其构建方法
本专利技术涉及高通量测序领域，具体而言，涉及一种高通量测序文库及其构建方法。
技术介绍
基因突变的方式有多种，包括SNP、插入、缺失、融合等情况。其中SNP、插入和缺失突变类型往往从DNA水平上就可以检测得到，而发生融合突变通常需要在RNA水平上才能检测到。目前，针对DNA水平(SNP、插入、缺失)的基因突变检测方法主要有ARMS(突变扩增阻滞系统)和Sanger测序法。ARMS：利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板碱基互补配对时才能出现目的PCR扩增带，从而检测出突变。该法检测样本有限，易受污染，且假阳性率高。Sanger测序法：依据双脱氧末端终止法，反应体系中合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。该法灵敏度较低，且实验操作较为复杂、实验周期较长、易受污染，并且检测样本数据有限。针对RNA水平(融合)的基因突变的检测方法主要有RT-PCR法和FISH(荧光原位杂交技术)。RT-PCR法：RT-PCR法一般分为两步：先将待检测标本的mRNA逆转录为cDNA，再结合特异性引物对目标片段进行荧光PCR扩增，根据扩增片段的大小来检测是否存在融合。该法操作复杂，易受污染，检测样本有限，只能检测已知突变类型。FISH：是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的靶分子在染色体或其他细胞器中的定位。该法成本高，技术难度较大，检测样本有限。由于在同一基因内，有可能仅发生上述一种类型的突变，也有可能同时具有两种或两种以上的突变类型。上述检测方法往往一次只能检测一个样本的一种类型变异，无法同时应对多样本、多基因、多检测类型的需求。然而，新兴的二代高通量测序技术为多基因、多类型突变的平行获取带来了希望。基于多重PCR的高通量测序方法能够在提高通量的同时节省样品降低成本，能实现数十个、百个甚至数千个位点的快速测序及低频率等位基因的检测。和其它高通量测序方法相比，基于多重PCR的高通量测序方法的难点就在如何提供一种适合进行多个目的片段、多个基因同时进行扩增的多重PCR的引物混合物。由于涉及的引物对较多，众多引物对混合在一起进行PCR扩增时容易相互之间产生影响，导致引物二聚体的增加、扩增效率和特异性下降以及非特异性目的片段的扩增，从而导致无法同时扩增得到多个目的片段。因而，在基于多重PCR的高通量测序方法所带来的优势已经被众人所知时，其在多基因、多片段的多种突变类型的平行获取方面的应用却仍然受到限制。因此，如何有效地利用上述基于多重PCR的高通量测序方法来进行多样本、多基因、多突变类型的平行获取，是目前亟待解决的一个技术问题。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种高通量测序文库及其构建方法，提供一种能够对多样本、多基因、多突变类型进行平行获取的方法。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种高通量测序文库的构建方法，该文库构建方法包括以下步骤：S1，利用引物混合物对多个目标区域进行多重PCR，得到多个目标片段；S2，对多个目标片段接头连接，得到多个带接头的目标片段；以及S3，对多个带接头的目标片段进行乳液PCR，得到高通量测序文库；其中，引物混合物为cDNA引物混合物和/或DNA引物混合物；当引物混合物为cDNA引物混合物时，cDNA引物混合物包括SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的第1对引物以及SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示的第2对引物；当引物混合物为DNA引物混合物时，DNA引物混合物包括SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示的第3对引物以及SEQIDNO：7和SEQIDNO：8所示的第4对引物。进一步地，当引物混合物为DNA引物混合物时，DNA引物混合物还包括SEQIDNO：9和SEQIDNO：10所示的第5对引物、SEQIDNO：11和SEQIDNO：12所示的第6对引物以及SEQIDNO：13和SEQIDNO：14所示的第7对引物。进一步地，当引物混合物为DNA引物混合物时，DNA引物混合物还包括SEQIDNO：15和SEQIDNO：16所示的第8对引物、SEQIDNO：17和SEQIDNO：18所示的第9对引物、SEQIDNO：19和SEQIDNO：20所示的第10对引物、SEQIDNO：21和SEQIDNO：22所示的第11对引物、SEQIDNO：23和SEQIDNO：24所示的第12对引物、SEQIDNO：25和SEQIDNO：26所示的第13对引物以及SEQIDNO：27和SEQIDNO：28所示的第14对引物。进一步地，当引物混合物为DNA引物混合物时，DNA引物混合物还包括SEQIDNO：29和SEQIDNO：30所示的第15对引物、SEQIDNO：31和SEQIDNO：32所示的第16对引物、SEQIDNO：33和SEQIDNO：34所示的第17对引物、SEQIDNO：35和SEQIDNO：36所示的第18对引物、SEQIDNO：37和SEQIDNO：38所示的第19对引物、SEQIDNO：39和SEQIDNO：40所示的第20对引物以及SEQIDNO：41和SEQIDNO：42所示的第21对引物。进一步地，当引物混合物为DNA引物混合物时，DNA引物混合物还包括SEQIDNO：43和SEQIDNO：44所示的第22对引物、SEQIDNO：45和SEQIDNO：46所示的第23对引物、SEQIDNO：47和SEQIDNO：48所示的第24对引物、SEQIDNO：49和SEQIDNO：50所示的第25对引物、SEQIDNO：51和SEQIDNO：52所示的第26对引物、SEQIDNO：53和SEQIDNO：54所示的第27对引物以及SEQIDNO：55和SEQIDNO：56所示的第28对引物。进一步地，当引物混合物为DNA引物混合物时，DNA引物混合物还包括SEQIDNO：57和SEQIDNO：58所示的第29对引物、SEQIDNO：59和SEQIDNO：60所示的第30对引物、SEQIDNO：61和SEQIDNO：62所示的第31对引物、SEQIDNO：63和SEQIDNO：64所示的第32对引物、SEQIDNO：65和SEQIDNO：66所示的第33对引物、SEQIDNO：67和SEQIDNO：68所示的第34对引物以及SEQIDNO：69和SEQIDNO：70所示的第35对引物。进一步地，当引物混合物为cDNA引物混合物时，cDNA引物混合物还包括SEQIDNO：71和SEQIDNO：72所示的第36对引物以及SEQIDNO：73和SEQIDNO：74所示的第37对引物。进一步地，当引物混合物为cDNA引物混合物时，cDNA引物混合物还包括SEQIDNO：75和SEQIDNO：76所示的第38对引物、SEQIDNO：77和SEQIDNO：78所示的第39对引物以及SEQIDNO：79和SE本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高通量测序文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：S1，利用引物混合物对多个目标区域进行多重PCR，得到多个目标片段；S2，对多个所述目标片段进行接头连接，得到多个带接头的目标片段；以及S3，对多个所述带接头的目标片段进行乳液PCR，得到所述高通量测序文库；其中，所述引物混合物为cDNA引物混合物和/或DNA引物混合物；当所述混合引物为cDNA引物混合物时，所述cDNA引物混合物包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的第1对引物以及SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的第2对引物；当所述混合引物为DNA引物混合物时，所述DNA引物混合物包括SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的第3对引物以及SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的第4对引物。

【技术特征摘要】
1.一种高通量测序文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：S1，利用引物混合物对多个目标区域进行多重PCR，得到多个目标片段；S2，对多个所述目标片段进行接头连接，得到多个带接头的目标片段；以及S3，对多个所述带接头的目标片段进行乳液PCR，得到所述高通量测序文库；其中，所述引物混合物为cDNA引物混合物，或者所述引物混合物为cDNA引物混合物和DNA引物混合物；当所述引物混合物为cDNA引物混合物时，所述cDNA引物混合物包括SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的第1对引物以及SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示的第2对引物；当所述引物混合物为DNA引物混合物时，所述DNA引物混合物包括SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示的第3对引物以及SEQIDNO：7和SEQIDNO：8所示的第4对引物。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，当所述引物混合物为DNA引物混合物时，所述DNA引物混合物还包括SEQIDNO：9和SEQIDNO：10所示的第5对引物、SEQIDNO：11和SEQIDNO：12所示的第6对引物以及SEQIDNO：13和SEQIDNO：14所示的第7对引物。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，当所述引物混合物为DNA引物混合物时，所述DNA引物混合物还包括SEQIDNO：15和SEQIDNO：16所示的第8对引物、SEQIDNO：17和SEQIDNO：18所示的第9对引物、SEQIDNO：19和SEQIDNO：20所示的第10对引物、SEQIDNO：21和SEQIDNO：22所示的第11对引物、SEQIDNO：23和SEQIDNO：24所示的第12对引物、SEQIDNO：25和SEQIDNO：26所示的第13对引物以及SEQIDNO：27和SEQIDNO：28所示的第14对引物。4.根据权利要求1至3中任一项所述的构建方法，其特征在于，当所述引物混合物为DNA引物混合物时，所述DNA引物混合物还包括SEQIDNO：29和SEQIDNO：30所示的第15对引物、SEQIDNO：31和SEQIDNO：32所示的第16对引物、SEQIDNO：33和SEQIDNO：34所示的第17对引物、SEQIDNO：35和SEQIDNO：36所示的第18对引物、SEQIDNO：37和SEQIDNO：38所示的第19对引物、SEQIDNO：39和SEQIDNO：40所示的第20对引物以及SEQIDNO：41和SEQIDNO：42所示的第21对引物。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，当所述引物混合物为DNA引物混合物时，所述DNA引物混合物还包括SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹志生，李宗文，张宝亮，张兰英，丁雪，宋超，孟雪红，魏龙刚，尹静妮，刘聪，
申请(专利权)人：天津诺禾致源生物信息科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12